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王建斌/黄岩谊/谢晓亮课题组PNAS发表RNAseq快速建库新方法,或将提供灵敏简单新型冠状病毒测序手段|附专家点评

RNA测序(RNA-Seq)是基于二代测序技术开展转录组学研究过程中广泛使用的一种方法,能够在特定时间点对生物样本中的多种RNA进行定性和定量分析。其中,单细胞RNA测序(scRNA-Seq)能够在单细胞水平上分析生物系统的复杂性,包括群体内部的复杂性和随时间变化的复杂性,已成为近些年生命科学研究领域中的热点方向。

目前针对RNA的测序方法都需要先将RNA转换为双链DNA,这个过程中二链DNA的合成是获得高质量测序文库的关键,也是现下相关方法学研究的重点。眼下使用最广泛的二链DNA合成方法主要基于RNaseH或者template switch活性的巧妙运用,但应用范围各有局限,总体操作较为复杂。

对从事NGS技术研发领域的人来说,Tn5转座酶应该都很熟悉。经过改造的Tn5转座酶,这几年成为了测序建库方法的新宠,除了可以高效切断文库加接头外,还衍生出了ATAC-seq、LIANTI以及META 等不少新的测序研究手段。ATAC-seq 因为操作简单和需要起始样品量极少, 成了染色体基础科研和临床研究的首选方法, 应用极其广泛。LIANTI 和 META则是谢晓亮团队开发出的单细胞DNA 精准扩增方法。对于转录组测序来说,目前通常还是先转化成双链的cDNA后,再考虑使用Tn5转座子来建库。如果Tn5转座酶能直接在RNA上作用,会大大简化RNA测序的建库, 也将会衍生出各种新的测序方法。

近日,北京大学的黄岩谊和谢晓亮研究团队联合清华大学王建斌研究团队完成的一篇名为“RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids”的研究论文以直接投稿(Direct Submission)方式发表在美国《国家科学院院刊》(PNAS) 。该研究开发了一种新的基于Tn5转座酶的转录组测序快速建库方法,与已有的其它方法相比大大简化了建库的过程,同时对样品的用量还很小,不仅可以用于高质量的单细胞转录组测序,而且对包括目前正在肆意蔓延的冠状病毒等样本的测序质量和速度或许也将有大大的提升。与谢晓亮教授此前发表的MALBAC、LIANTI等方法一样,研究团队继续以红酒的名字来命名,并起名为SHERRY(Sequencing HEteRo RNA-DNA-hYbrid )。

图:SHERRY转录组测序建库流程。来源:PNAS

基于SHERRY方法的转录组测序建库流程如上图所示,样本可以来自单细胞裂解液或bulk RNA;RNA分子经过oligo-dT 引物的反转录后,RNA/DNA杂合链可直接被Tn5转座酶打断(图中灰色的波浪线及直线分别代表RNA及DNA分子);在Tagmentation之后,转座酶会在杂合链两端加上adaptor接头,进行之后的建库PCR扩增。
基于100pg的RNA起始量,SHERRY表现出了高的read匹配率,同时可检测出近9000个基因,其中72%的基因可在三个重复样本中检测出,可重复性较好。与目前普遍应用于单细胞转录组测序的Smart-seq2技术相比,SHERRY与其建库质量不相上下,并且具较低的GC bias。此外,SHERRY整个流程仅需要5个步骤,且可在一个管子中完成,整个时间仅约4小时,其中手工操作时间不到半小时。相比之下,Smart-seq2整个耗时约为SHERRY二倍的时间,且需要一些前处理等操作;此外,包含十个步骤的NEBNext方法则需要更加多的实验室操作和时间成本。值得一提的是,在成本方面,SHERRY方法仅为其他两种方法的五分之一,将大大节省实验成本。

图:Smart-seq2, SHERRY 及NEBNext流程及成本比较。来源:PNAS

文章通讯作者之一,北京大学谢晓亮教授谈到:“虽然SHERRY 应用广泛,当下我们第一个临床应用是对nCoV感染者进行测序。nCoV病毒属于RNA 病毒,其序列已被中国科学家测出,从而有了刚刚获得药监局批准的几家nCoV检测试剂盒。这些试剂盒利用 RT PCR 的方法对病毒的某一位置定点测量。而这2万9千碱基的病毒突变很多,且随时间变化,因而亟需测序。SHERRY应该比现有的RNA 测序建库方法更灵敏,更简单。这对nCoV的检测和分析十分重要,因为我们希望避免在高封密(P3 和 P4)实验室中的RNA 富集操作。我们的团队正在夜以继日,争分夺秒地攻关,希望提供更好的nCoV 测序方法。”
据介绍,该论文的两位共同第一作者是北京大学生物医学前沿创新中心(BIOPIC)的博士研究生狄琳和傅语思,大部分的实验工作在清华大学和北京大学合作下完成。这一工作的合作者还包括南京师范大学王冠博教授、美国XGen公司劳开勤博士团队以及美国加州大学圣地亚哥分校王栋教授团队。该工作得到了国家自然科学基金、国家科技部、北京未来基因诊断高精尖创新中心、北京结构生物学高精尖创新中心、北京脑科学计划以及深圳湾实验室的支持。

专家点评

何川 教授

美国芝加哥大学

这篇文章开发的SHERRY方法本身很巧妙,利用了一个新发现的Tn5转座酶功能——可以直接识别DNA/RNA的杂合链并进行切割和连接。这从根本上绕过了二链DNA合成这一步,大大简化了操作。对于Tn5可以直接作用于RNA/DNA杂合链功能的发现,一下子开辟了一条新的道路,在微小起始量转录组测序中,比起常规操作要大大简化,同时保持了高度可靠的结果。这一方法应用于单细胞的转录组测序时,还消除了建库早期的cDNA在PCR过程中带来的额外偏差。最有拓展意义的是,实际上所有基于测序方法来研究RNA片段的工作,都可以利用这一方法来大大简化过程,提高工作效率。我就想到了好几个我自己研究组马上可以试的想法。这是个非常有意义的突破。
任丽丽 研究员

中国医学科学院病原生物学研究所

前一段时间,在预印版上看到北大和清华的谢晓亮、黄岩谊、王建斌三个课题组联合发表的关于快速RNA-seq建库方法的文章时就非常期待,很快文章就正式发表在PNAS上。他们这一方法起的名字很简洁叫SHERRY,建库流程也简洁明快。能够从微量样本开始,与现有建库方法相比时间缩短了一半多,消耗人力也减少一半多,很适合用于相对低起始量样本的建库,例如我们常做的那些人呼吸道来源的样品等,对样本内包括冠状病毒等的测序质量和速度应该也会有大大的提升。在疾控和临床开展未知病原鉴定时,短时间要给出明确的分析结果。这种可以大大缩短建库时间、保证高质量数据的建库方案是非常有实用前景的。还有一点就是价格便宜。期待这一团队能够不断有更多的好点子。
参考资料:
RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids. PNAS.2020
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本文由 测序中国 作者:陈初夏 发表,转载请注明来源!

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