荷兰马斯特里赫特大学医学中心的研究团队及合作者评估了HiFi长读长测序检测所有类型DNM的能力。近日，该团队在Genome Medicine发表了题为“Comprehensive de novo mutation discovery with HiFi long-read sequencing”的研究文章。研究团队仅通过HiFi长读长测序这一单一技术，构建了最全面的突变数据集，实现了准确的替换、indel、STR和SV检测。该技术的准确性甚至允许在所有不同变异水平上灵敏地检测DNM，并且还允许定相（phasing），有助于区分真阳性和假阳性DNM。

文章发表在Genome Medicine

与短读长测序相比，HiFi测序增加的碱基精度对于小DNM的检测尤其有利，甚至可以提高灵敏度。此外，与其他长读长测序技术，HiFi技术不存在高度不稳定化学，其数据质量比较稳定，并且HiFi测序可以达到99.9%的准确度。因此HiFi可谓基因组学研究中应对复杂挑战的一个利器。

为证明长读长测序在新突变检测中的实用性，研究团队使用高覆盖深度PacBio HiFi长读长测序（~30倍）和Illumina短读长全基因组测序（~ 50倍），对8个父母-后代三人组的基因组进行了测序。对于HiFi长读长测序，研究获得的平均reads长度为17kb。每个样本的570万reads中超过99.0%与参考基因组对齐，映射质量为46.5。

数据显示，平均而言，每个样本有380万个替换突变在两个测序平台之间共享，相当于长读长和短读长测序检测的一致性为94.0%。在HiFi长读长测序特有的替换突变检测中，大约一半突变是在短读长测序没有覆盖的区域检测到的。研究发现，HiFi长读长测序提供了大约240Mb基因组的序列覆盖，而短读长测序没有，并且在这些区域，HiFi长读长测序的孟德尔遗传错误率仅为2.1%，表明大多数变异调用是真实的。

对于indel，HiFi长读长测序平均每个样本产生100万个突变，短读长测序平均产生90万个indel。短读长测序的一致性为63.1%，HiFi长读长测序的一致性为58.0%，大约有25% indel是在短读长测序没有覆盖的区域中检测到的。此外，HiFi长读长测序独有indels的MIE比率（8.9%）低于短读长测序独有indel的MIE比率（13.0%），表明HiFi长读长测序对indels的检测能力更好。

整体而言，HiFi长读长测序的准确度可以实现在所有变体水平上灵敏地识别DNM，还可以实现定相，有助于区分真阳性和假阳性DNM（图1）。

图1. 研究概览：对八个父母-后代三人组进行了PacBio HiFi长读长测序和Illumina短读长测序。

在相同样本上进行长读长测序和短读长测序，目的是识别包括替换突变在内的所有变异类型。其中，研究人员重点评估了HiFi长读长测序全面识别小变异和SV的准确性。通过HiFi测序，经过严格的筛选标准，总共发现672个小DNM，每个儿童平均识别到84个小DNM。平均而言，这84个变体中有75个是单碱基替换，在2bp到50bp之间有4个插入和5个缺失。将HiFi长读长测序检测到的小DNM与短读长测序检测到的替换突变相比较，显示出92.0%的一致性（图2）。短读长测序发现859个小DNM，平均每个患者107个小DNM，包括95个替换、4个插入和8个缺失。短读长测序检测小DNM与HiFi长读长测序的一致性为84.5%。

为了评估HiFi长读长测序对小DNM检测的灵敏度，研究人员成功为54个小DNM的27个设计出Sanger测序的标准引物。在引物设计成功的27个DNM中，11个被确认为是真正的DNM，5个在儿童中未被确认，因此被认为是假阳性（图2）。经验证识别的小DNM质量分数平均显著高于遗传和假阳性DNM。

图2. 所有小DNM的概述。

研究团队分析了两个平台在替换突变和indel检测方面是否存在差异。能够进行验证的27个HiFi长读长测序特有小DNM包括13个替换、10个插入和4个缺失，其中插入和缺失没被确认为真正的DNM，有11个替换被确认为真正的DNM。对于HiFi长读长测序检测的插入和缺失，70和75%遗传自亲本，30%和25%是假阳性检测。对于短读长测序检测到的独有突变，9.5%的替换、0%的插入和83%的缺失为遗传，68%的替换、100%的插入和17%的缺失是假阳性检测。

对于STRs，研究团队利用串联重复序列目录，其中包含171146个高度多态性重复位点。研究人员尝试验证18个HiFi长读长测序独特的和18个短读长测序独特的高质量从头STR检测。结果显示，HiFi长读长测序和短读长测序的独特STR均没有被确认为真正的从头重复扩展。

除了替换、indel和STR外，研究人员还识别了从头SV。结果显示，HiFi长读长测序数据中识别到了24个候选从头SV，短读长测序数据中识别到了1个候选从头SV（图1D）。在短读长测序和HiFi长读长测序中都出现的1个SV为真正的从头突变，其余23个长读长测序识别的突变包含13个插入、8个缺失和2个重复（长度范围21bp-991bp），其中有2个已被证实为真正的从头SV（图3）。

图3. 仅通过长读长测序就检测到两个已确认的真正从头SV。

此外，依赖于HiFi的高质量数据，使用长读长测序可实现对DNM的分相，帮助区分真阳性和假阳性DNM，并根据遗传变异（即标记物）确定起源亲本（图4）。

图4. DNM的分相。

以上结果表明，可以通过单一技术——HiFi长读长测序生成全面的WGS数据集，从而准确识别替换、indel、STR和SV。这意味着仅通过一次全面的检测，即可对疑似遗传原因导致的罕见病患者进行真正全面检测。该技术的准确性对于严重早发性疾病的诊断意义重大。

参考来源：

1.Kucuk, E., van der Sanden, B.P.G.H., O’Gorman, L. et al. Comprehensive de novo mutation discovery with HiFi long-read sequencing. Genome Med 15, 34 (2023). https://doi.org/10.1186/s13073-023-01183-6

https://www.pacb.com/blog/ploidy-haplotypes-and-phasing/