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厉害了,成本仅为WGBS一半!牛津大学成功开发新型DNA甲基化测序方法

DNA甲基化有足够的潜力作为癌症的生物标志物,用于筛查、预后以及疗效监测。在表观遗传中,最常见的甲基化修饰就是胞嘧啶甲基化和羟甲基化,产生5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。已有研究表明,异常的5mC和5hmC模式是癌症的典型特征。

目前,亚硫酸氢盐测序是DNA甲基化检测的金标准。几十年来,生物学家多是依靠亚硫酸氢盐来检测5mC和5hmC。但这种测序方法仍有极大的限制,由于亚硫酸氢盐对DNA的降解率达99%,在处理有限的样本时(如血液中的cfDNA),亚硫酸氢盐测序将变得非常具有挑战性。此外,亚硫酸氢盐测序是间接检测5mC和5hmC。由于未修饰的胞嘧啶约占人类基因组总胞嘧啶的95%。将所有未修饰的胞嘧啶转换为尿嘧啶会严重降低序列复杂性,导致测序质量差,定位效率低,基因组覆盖不均匀和测序成本增加,这极大地限制了表观遗传的研究应用。

图1. 宋春啸(左)和Benjamin Schuster-Boeckler(右)。来源: LUDWIG CANCER RESEARCH

为准确检测DNA甲基化水平,最好的方法就是在不影响未修饰胞嘧啶和高分辨率的前提下,直接检测5mC和5hmC。2月25日,牛津大学路德维格癌症研究所宋春啸和Benjamin Schuster-Boeckler在Nature Biotechnology发表文章,报道了一种新的DNA甲基化测序方法:TET辅助吡啶硼烷测序(TET-assisted pyridine borane sequencing,TAPS)。与亚硫酸氢盐测序相比,TAPS无需亚硫酸氢盐,可对目标序列直接进行DNA甲基化测序,是一种破坏性更小、效率更高的单碱基分辨率DNA甲基化测序方法。

传统的DNA甲基化测序多是将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,新开发的TAPS“反其道而行之”,可在不影响未修饰胞嘧啶的前提下,实现5mC和5hmC的直接检测。TAPS方法包括两个步骤:首先利用TET酶将5mC和5hmC转化为第三种修饰,即5-羧基胞嘧啶(5caC)。然后,利用宋春啸教授实验室开发的一种新化学反应,将5caC转化为胸腺嘧啶,就可以通过普通测序仪直接测序。

研究数据显示,TAPS能够以高灵敏度和特异性检测DNA甲基化,保留DNA片段可超过10kb。同时,研究人员还基于TAPS开发了两种新方法:TAPS-β和CAPS,它们分别仅用于检测5mC或5hmC。

图2. Sanger测序结果显示,TAPS仅将5mC转换为T(左图);通过HPLC-MS / MS定量dC和各种胞嘧啶衍生物的转化率(右图)。

图3. TAPS,TAPS-β和CAPS方法概述。

TAPS测序会产生一种新型数据,对此,研究人员针对性开发了数据分析所需的计算方法。与亚硫酸氢盐测序相比,TAPS数据的处理速度不仅快了2倍,而且还能保留样本更多的原始信息,使得在DNA甲基化检测中,基因突变检测和结构变异检测变得更加容易。

试验中,研究团队将TAPS应用于小鼠胚胎干细胞全基因组甲基化测序。结果表明,使用TAPS可检测E14基因组42,741,339个CpG位点中的88.3%,而WGBS仅为77.6%。TAPS的覆盖范围更均匀,定位效率更高,可以生成更精确的测序数据。此外,TAPS测序成本仅为WGBS的一半。这意味着,耗费同样多的钱,TAPS可以获得两倍多的有效数据,有助于进行更高质量、更全面的基因分析。

图4. 不同方法对E14基因进行至少三次读取的CpG位点覆盖情况,包括仅使用TAPS方法,TAPS和WGBS,仅使用WGBS方法。

在证明TAPS方法起作用后,该团队又花了一年时间来完善,使其反应效率从约70%提高到95%以上。目前,TAPS可与多种下游分析技术兼容,包括但不限于甲基化敏感性PCR、限制性酶切、质谱、全基因组测序等,还可与其他测序方法结合,进一步降低成本,提高分辨率。例如,TAPS可保留较长DNA序列,因此与长读长测序技术(如SMRT测序和纳米孔测序)结合或可用于研究某些此前难以研究的基因区域。此外,研究团队目前正在改进TAPS,利用其检测单细胞和血液中的ctDNA,以开发微创、无创的癌症诊断技术。

表观遗传修饰也被称为隐形标记,可控制基因表达及其在基因组中的分布。深入了解表观遗传信息有助于研究跟踪癌症的发生进展和抗药机制。TAPS方法的开发使表观基因组测序更加准确、经济,也有利于DNA甲基化测序能更广泛地应用于学术研究和临床。随着测序技术的不断发展,相信会有更多更好的甲基化测序技术出现,取代亚硫酸氢盐测序,成为表观基因组测序的新标准。

参考资料:

1.A new sequencing method to detect DNA modifications of relevance to cancer

2.Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution

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本文由 测序中国 作者:戴胜 发表,转载请注明来源!

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