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科学家发现CRISPR-Cas9技术背后的“潜规则”,基因编辑结果或有规可循!

随着基因编辑技术的发展,CRISPR-Cas9基因编辑系统已成功用于各种生物体的基因组编辑,靶向基因编辑猴、基因敲入食蟹猴、亨廷顿舞蹈症基因敲入猪都是成功案例。但不可否认的是,有关编辑效率和脱靶效应的争议一直存在。很多人认为基因编辑的结果更像是随机的,无法预测,甚至可能产生意想不到的各种“bug”。上个月,在全球热议的“基因编辑婴儿”事件中,除了伦理方面质疑,另一个争议点就是脱靶效应以及基因编辑结果的评定。结果不可预测、脱靶效应已经为基因编辑技术的发展和应用带来了极大的困扰。

为解决这一问题,众多科学家在基因编辑技术提升、改善脱靶效应等方面不懈努力,也有科学家想要在结果预测方面取得突破。近日,有一个研究团队在基因编辑结果预测方面有了新发现,CRISPR-Cas9基因编辑系列过程的背后有一种简单可预测的模式。或许这将从根本上改变我们使用CRISPR技术的方式,使我们能够更精确地研究基因功能,加速科学研究进程。

来自英国Francis Crick研究所的研究人员对CRISPR-Cas9基因编辑的人类细胞中的近1500个靶点进行了系统分析,发现CRISPR-Cas9介导的编辑结果是可预测的,不同位点间的基因编辑精确度(即特定indel的重现性)差异较大,某些靶点高度偏好一种indel,而另一些则显示出许多不常见的indel。12月14日,该研究结果发表在Molecular Cell上。

研究成果概述图

为研究Cas9核酸酶诱导的indel模式,研究人员选择了450个核基因中的1491个位点(每个基因至少选择3个位点),并使用具有高预测活性的多个sgRNA对其进行定位。研究结果显示,共有1248个位点显示出可检测到的indel,每个靶点有1个到188个数量不等的indel,中位数为32。

在该研究中,研究团队观察到多种常规编辑模式。其中,44%和26%的靶点分别显示单核苷酸插入或缺失,是大多数靶点最常见的indel类型。还有41个核苷酸位点显示出较长片段的缺失。根据聚类分析结果,研究人员将表现相似indel模式的靶点分为4种,即偏好小片段插入,小片段缺失,长片段缺失以及无明显偏好的位点。平均而言,给定位点最常见的indel频率为34.1%。

研究团队指出,约五分之一的靶点至少有50%的机会能诱导特定的indel。某些位点会出现多个不常出现的不同indel,而一些位点会主要显示某一indel。表明不同位点不仅对基因编辑的类型有不同的偏好,而且在数量上也有偏好,CRISPR基因编辑的精确度在特定位点是可以预测的,但并不是所有位点都可以。

基因编辑精度与indel特征的关系

数据分析表明,基因编辑精度与编辑效率、indel类型和indel大小有关,并且某些DNA序列对编辑精度有显著影响。如PAM序列(一种可被Cas9蛋白特异性识别并切割的短核苷酸基序)上游的四个核苷酸会对编辑精确度产生影响,其中第四个单核苷酸的影响最大。虽然第二、第三和第五个核苷酸也有作用,但都比第四核苷酸弱。值得注意的是,仅一个“T”的存在,就能以一种可预测的方式使该位点的修复概率达到51%,以及91%的概率引入插入。研究人员认为,精确靶点和基因编辑结果或许可以根据这一简单规则进行预测。

CRISPR诱导的indel常常导致移码突变。平均而言,80.1%的indel会在一个特定的位点被诱导,进而破坏基因编码框。该研究中,所有检测到的indel中有81%导致了移码突变,有3个位点对编码框内indel显示出强烈的偏好,表明在某些情况下,有些位点很难成功诱导基因敲除。

该研究发现有助于我们检测不同位点的基因编辑精确度,在很大程度上揭示了基因编辑精确度的范围。如果能够提前预知某一特定位点的基因编辑偏好性和编辑结果,将有助于科研及临床应用中期望编辑序列的研究。此外,indel模式具有极高的重现性,选择精确的靶标并在模型系统中进行实验验证,可以大大提高临床应用的安全性。

基因编辑技术对于生命科学发展的意义毋庸置疑。长久以来,人们对其编辑结果不可预测的争议,在一定程度上限制了该技术的应用推广。该最新研究发现在特定位点的CRISPR基因编辑结果可预测,证明我们对基因编辑技术的认识还只是冰山一角,在技术的背后还有更多需要我们去探索。同时,在可预知结果的前提下,相信CRISPR-Cas9技术的应用也会越来越广泛。希望在不远的未来,基因编辑技术能够为疾病治疗等众多研究领域开启新的大门。

参考资料:

1. Target-Specific Precision of CRISPR-Mediated Genome Editing

2. Genome Editing Patterns Could Help Predict CRISPR Outcomes

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本文由 测序中国 作者:戴胜 发表,转载请注明来源!

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