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最新进展 | 两种单细胞转录组分析新方法,可提高灵敏度和扩展性

导语

近日,两个研究小组分别发表了新的单细胞RNA测序方法,旨在解决现有方法低灵敏度和有限的可扩展性带来的挑战。在一篇论文中,贝勒医学院的研究人员描述了一种被称为“多重退火和基于dC尾的定量单细胞RNA测序(MATQ-seq)”的方法,可以发现基因表达的微小差异。在另一篇论文中,10X Genomics公司和Fred Hutchinson癌症研究中心报道了他们的Chromium Single Cell 3' Solution方法,可以一次分析数千个免疫细胞。

1. MATQ-seq方法:增加RNA-seq的灵敏度

MATQ-seq方法发表在《Nature Methods》上,旨在通过提高逆转录效率和随后PCR扩增子的产生来增加RNA-seq的灵敏度。

文章通讯作者Chenghang Zong表示,“灵敏度一直是单细胞RNA-seq方法的一个关键限制,以前方法的低灵敏度也进一步限制了准确性。而MATQ-seq方法提供了高灵敏度和准确性,可以检测相同类型的单个细胞之间基因表达的细微差异,并且能给予研究人员捕获非多聚腺苷酸化RNA的能力。”

MATQ-seq方法受“多重退火和成环循环扩增(MALBAC)”技术中所用引物的启发,使用主要由G、A和T碱基组成的引物。同时,为了减少在第二条链合成之后PCR扩增期间引入的偏差,该方法使用随机六聚体独特的分子标识符在扩增和测序之前来对分子进行标记。

在使用ERCC开发的RNA spike-in作对照后,研究人员计算出MATQ-seq的捕获效率为89.2%。与其他单细胞RNA-seq方法如SMART-seq2或SUPeR-seq分析HEK293T细胞的能力相比,他们报告MATQ-seq方法没有3'和5'端偏差,并且对低丰度基因的检测效率增加。

另外,Zong等作者指出,MATQ-seq可以检测相同类型的单个细胞之间基因表达的差异。例如,他们能够在几个细胞内检测到转录的爆发(transcriptional bursts)。当他们将38个单细胞随机分成两个细胞集时,他们注意到这两个细胞集的平均法诺因子——基因表达的方差与平均值的比率——相关。但是,当他们将单细胞本身的法诺因子与单细胞平均值进行比较时,没有发现相关性,这表明他们的方法可以捕获由于转录爆发而出现的单细胞基因表达中的变异。

2. Chromium Single Cell 3' Solution方法:为单细胞转录组研究提供更具扩展性的平台

用于单细胞RNA-seq的现有方法在扩展到数万或更多细胞的吞吐量时面临实际挑战。10X Genomics公司和Fred Hutch团队使用基于液滴的方法,为单细胞转录组研究提供更具扩展性的平台。他们的方法发表在《Nature Communications》上,使用建立在GemCode技术上的微流体平台,将带有条形码的凝胶珠、指数分子和引物等与油中的单细胞结合。在每个液滴内,在乳化破碎后,进行逆转录以产生用于测序的带条形码的cDNA。

研究人员表示,这种细胞封装方法具有约50%的捕获效率,并且可以在约6分钟内发生。该方法还可以用于分析来自29个不同样品的约25万个单细胞,并基于它们的SNV区分单个细胞。

由Fred Hutch的Jason Bielas领导的团队使用这种方法来分析从两名AML患者中获得的17,000个骨髓单核细胞样品,这些样品来自他们接受同种异体造血干细胞移植之前和之后。研究者指出,在治疗之前,这些样品中每个细胞的独特分子标识符计数是健康细胞的三倍到五倍,这可能反映了白血病细胞的异常转录程序。

研究者注意到在一个患者的移植后样品中存在两种基因型,所占比例分别为13.8%和86.2%,反映了宿主和供体的基因型。然而,在另一个患者中,他们仅检测到宿主的基因型。这两个发现都用临床嵌合体试验进行了验证。

基于SNV分析,研究人员还比较了样品中的细胞亚群。对于第一个患者,他们发现移植前的红细胞(反映了患者的红白血病诊断结果)和移植后的原始和未成熟红细胞(与患者经历过复发相一致)水平高。他们补充说,如果采用荧光激活细胞分选(FACS)方法对此进行检测则较难,因为早期红细胞的标记数量有限。

Bielas说,“我们不用在显微镜下观察或者知道这些细胞表面上的蛋白质模式,就能确定细胞的身份。这可能有助于从缺少细胞表面标记的特定谱系中寻找白血病细胞。”

参考文献:

Effective detection of variation in single-cell transcriptomes using MATQ-seq. Nature Methods (2017) doi:10.1038/nmeth.4145

Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications, doi:10.1038/ncomms14049

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本文由 测序中国 作者:戴胜 发表,转载请注明来源!

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