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武汉大学联合团队开发纳米孔靶向测序法,较qPCR阳性率检测率提升43.8%,可实现最快10分钟测序检测

 前 言

既往COVID-19诊断依赖于qPCR核酸检测,但是该方法显示出较高的假阴性率和低敏感性(阳性检出率仅为30%至50%),从而导致临床高度疑似新冠感染患者或低病毒潜伏的“假痊愈患者”检测“假阴性”现象频发,此外,qPCR核酸检测无法同时检测其他秋冬季高发、症状与新冠相似的其他呼吸道病毒,给疫情防控和患者分流管理带来了挑战。

身处疫区一线的武汉大学刘天罡教授、武汉大学人民医院李艳教授、余锂镭教授、武汉臻熙医学检验实验室有限公司总负责人付爱思博士等组建的联合团队创新性开发了纳米孔靶向测序(Nanopore Targeted Sequencing, NTS)检测方法该方法结合了病毒靶向扩增和纳米孔测序长读长、实时数据输出的优势,首次实现测序后4小时内高敏感性、高准确性同时检测SARS-CoV-2和其他10大类、40余种呼吸道病毒,其最低检测限高于目前广泛使用的qPCR的100倍。同时该方法还可实现对新型冠状病毒基因组变异情况进行检测,监控病毒变异引起的毒性与传播能力改变的情况。

该团队在2020年2月29日在预印版平台medRxiv 投稿题为“Nanopore target sequencing for accurate and comprehensive detection of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses “的研究论文:

研究团队平行测试了NTS和qPCR,结果表明:45个临床高度疑似新冠感染患者的样品,NTS共鉴定出34个阳性样品,比qPCR多出15个;16个临床已确诊新冠感染患者中,NTS全部检测阳性,qPCR仅9个阳性。临床确诊样本显示NTS比qPCR的阳性检出率提升43.8%。除此之外,在这61个样本中,原本qPCR鉴定为可疑阳性的18个样本,利用NTS鉴定其中14例均为阳性, 此外,对于高浓度病毒样本,NTS仅需测序10分钟即可检测阳性,即使极低浓度病毒样本,也仅需测序4小时完成检测,NTS的高敏感性、高鉴别性、高速度性,对鉴别临床的疑似病例、助力疫情防控具有重大意义!

 

一、新冠确诊问题引发的思考

 

疾病本身

早期临床以发热、干咳、乏力、影像学磨玻璃影等典型临床表现作为COVID-19诊疗依据,但随着对疾病的认识,诸多患者出现非典型症状、影像学表现和实验室指标,个别患者甚至出现无症状感染,潜伏期延长至24天,在此期间,病毒可以从感染者传播到未感染COVID-19的起病隐匿、潜伏期长、患者群体众多等因素为临床确诊增加了难度。

截止2020年3月1日,国内COVID-19累计确诊79,968例,死亡2873例,但仍存在851例临床疑似但无法确诊病例,国外累计确诊7053例,累计死亡105例,疑似病例数据不详。

目前检测方法

  • qPCR方法:

仅针对病毒基因组上2-3个位点进行检测分析,覆盖<0.5%病毒基因组,样本在采样、存储、检测过程发生中稍有偏差,会导致仅针对少数基因位点的PCR检测手段的效率降低,甚至漏检,造成“假阴性”,且检测区域一旦发生变异,会造成检测结果失效。

  •   传统基因测序方法:

宏基因组测序(mNGS)由于其技术操作复杂、仪器设备较大、检测周期长等缺陷,绝大多数医院无法独立运用此技术开展常规检测工作,而生物安全性的问题也使运输到第三方医学检验机构不具有操作性。  

  • 新冠特异性抗体IgM、IgG :

新冠IgM特异性抗体:检测患者感染的第7天后产生lgM抗体,18天后快速消失,受限于抗体产生的时间和载量。

新冠IgG特异性抗体:新冠感染后18天方显著上升,且IgG阳性表明机体有感染,但不能区分是现症感染还是既往感染。换言之,IgG阳性者可能是正在受感染者也可能是以前感染过,体内产生了抗体,是感染产生的痕迹

简而言之,核酸检测的是病毒RNA(核糖核酸),是病毒存在的直接证据;抗体检测是检测患者血液中被刺激产生的抗体,是间接证据。

 

二、纳米孔靶向测序的评估

 

方法学优势

  • 靶向扩增:

研究团队开发的NTS技术不局限于中国或美国疾病控制中心(CDC)目前在qPCR方法中推荐的位点,而是将检测范围扩大到9个基因、12个位点,近10 kb区域,全面覆盖病毒基因组上主要基因区域,100%覆盖病毒基因组上毒力相关的重要基因,检测病毒基因组范围提升100倍,显著提高检测敏感性和准确性。

  • 测序:

借助纳米孔测序平台的两大优势:以对长核酸片段进行测序,并实时分析输出数据。纳米孔靶向测序可以在测序后几分钟至数小时确认SARS-CoV-2感染,同时,测序分析出的准确核酸序列可以表明在病毒传播期间与毒力相关的基因是否发生了突变,从而迅速为后续的流行病学分析提供信息。

  • 便捷:

纳米孔测序平台对实验室要求不高,其中最小测序仪MinION是便携式的,因此NTS也适合不同级别的医院使用。NTS对于新冠病毒具有高敏感性、高准确性优势,以及能够区分新冠病毒和其他常见呼吸道病毒的特点,使其非常适用于疑似病例的诊断,特别是目前用其他方法无法甄别的病人的诊断。

上图为本文研究团队在武汉新型冠状病毒定点医院利用NTS进行检测

  • 最低检测限:10 copies/mL

研究团队使用了带有COVID-19病毒S和N基因的标准质粒来模拟SARS-CoV-2,将标准质粒分别以10、100、500、1000、3000加入背景cDNA样品,结果显示:即使是最低10个拷贝/ml,当测序时间达到1小时时,10 copies/mL的测序数据与阴性对照有显著差异(p<0.05)NTS的最低检测限为:10 copies/mL

  • 检测速度:测序最快实现10min 

研究团队在该实验中证实高拷贝样品(1000、3000 copies/mL)可以快速(<10分钟=产生足够的有效测序数据进行诊断,即使是最低拷贝样品(10 copies/mL),4小时内也可获得有效测序数据。最终,实现测序10分钟数据用于快速检测;4小时最终报告

 

、临床研究

 

早期疑似新冠45例

研究团队收集了45个疑似新冠感染的样本,平行进行qPCR和NTS检测,结果显示:NTS在45个临床高度疑似感染样品中共鉴定出34个阳性样品,比qPCR多出15个,NTS检测灵敏度高于标准qPCR,在这61个样本中,原本qPCR鉴定为可疑阳性的15个样本,利用NTS鉴定其中11例均为阳性,显著提高新冠检测的阳性率和对可疑阳性患者的甄别能力

确诊新冠感染16例

研究人员对临床已确诊新冠感染(临床诊断、既往核酸检测)的住院患者平行进行NTS和qPCR检测,结果显示:

16个病例NTS全部检测阳性,100%吻合,而qPCR仅9个阳性,56.2%吻合。NTS检测阳性率提升43.8%。此外,3个qPCR可疑阳性均被NTS鉴定阳性,结果表明NTS在病毒处于低载量时,由于其高灵敏性,可显著弥补qPCR造成的“假阴性”问题,辅助临床得到准确、可靠的判断!                     

 

病毒变异监测

qPCR方法无法提供病毒基因序列信息,难以系统的分析病毒溯源、病毒的传播和变异演化的疫情防治与监控,而研究团队开发的NTS检测技术对19个来自门诊患者,已用qPCR确认阳性的样本进行了突变筛查,结果显示:

在4个样本中发现了7个位点的单核苷酸突变,与2020年2月8日之前在GISAID数据库中报告基因组数据相比,NTS监测到的部分突变在GISAID被识别,部分突变未被识别,表明了NTS检测到的突变在不同菌株中的多样性,以及该病毒可能带有现有基因组范围的测序方法尚未表征的突变。

 

四、NTS拓展检测:其他呼吸道病毒

 

目前,有肺炎和发热症状病人感染的不仅是SARS-CoV-2, 区分不同类型的呼吸道病毒感染引起了全世界的关注。而当前临床上使用的SARS-CoV-2 qPCR试剂盒无法识别共感染病毒的种类,同时qPCR的假阴性率较高,延误了患者的早期分诊,从而浪费了宝贵的医疗资源并增加了潜在的交叉污染。

研究团队开发的NTS可检测呼吸系统常见10大类,40余种呼吸道病毒,包括博卡病毒,鼻病毒,人间质肺病毒,呼吸道合胞病毒,冠状病毒,腺病毒,副流感病毒,甲型流感病毒,乙型流感病毒和丙型流感病毒。研究团队在检测中已发现有病人同时感染了SARS-CoV-2和甲流病毒H3N2。

 总结与展望 

 

该联合团队创新性开发NTS检测技术用于新型冠状病毒肺炎COVID-19检测与防控,同时具备以下特点:

1. 高灵敏:检测低丰度的病毒,弥补qPCR检测“假阴性”问题,助力早期诊断、提示早期感染风险。

2. 高速度:测序10分钟快速检测;测序4小时最终报告,全程从样本送达到出具结果控制在6-10小时,首次基于测序平台实现全程当天出具结果。

3. 检测范围广:除新型冠状病毒(SARS-CoV-2)外,还可以检测其他10大类、40余种呼吸道病毒引起的感染,分类管理,辅助快速确定诊疗方案。

4. 病毒信息全:可以同时实现病毒检测和病毒突变情况监测,为疫情监测提供可进行诠释和实时的流行病学信息。

5. 方法简易便携:适合在医院和CDC等实验室开展,在资源有限的环境中,可以快速使用和监控疫情。NTS对于新冠病毒具有高敏感性、高准确性优势,以及能够区分新冠病毒和其他常见呼吸道病毒的特点,使其非常适用于疑似病例的诊断,特别是目前用其他方法无法甄别的病人的诊断

感谢战斗在一线的医护人员和检验人员!希望新的技术能够帮助武汉、帮助中国、帮助全球战胜这次疫情!

*Nanopore产品目前仅供研究使用。

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本文由 测序中国 作者:戴胜 发表,转载请注明来源!

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