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张锋等人开发基于CRISPR的新冠病毒检测方法,可在1小时内完成,尚需临床验证

近日,世界卫生组织已正式命名新型冠状病毒引起的疾病为COVID-19。COVID-19疫情的爆发给全球人类健康带来了巨大挑战。新型冠状病毒核酸检测是患者临床确诊和康复出院的重要依据,也是接触者解除隔离的重要判断依据。目前,新型冠状病毒核酸检测大多通过qPCR进行,但是无法获得足够的试剂和设备会减慢检测的速度。世界卫生组织在本周召开的新型冠状病毒研究大会上,明确指出“开发准确并且使用简便的诊断检测”是当务之急。
为了帮助推进诊断速度,Broad研究所的张锋教授团队联合McGovern脑科学研究所等合作机构基于CRISPR技术,开发了适用于新型冠状病毒RNA的检测方法。该方法可准确检测20~200 aM的病毒靶序列(每微升10~100个拷贝),并可在1个小时内完成。需要注意的是,该检测方法仅是初步研究,不能作为临床诊断,并且尚未在患者样本上进行测试验证。相关研究成果已经提交到bioRxiv
该检测方法利用了张锋教授团队此前开发的SHERLOCK技术。已有研究显示,基于CRISPR-Cas13的SHERLOCK技术可准确检测患者样本中多种不同病毒的存在,对RNA和DNA的检测灵敏度都达到了单分子级(点击查看此前报道)。该技术可通过检测独特的核酸特征,并只需将基因试纸浸入处理过的样本中,试纸上会显示出一条线,指示是否存在病毒。
在该最新研究中,研究团队使用合成的新型冠状病毒RNA片段,设计并检测了两个可识别新型冠状病毒特征的向导RNA:一种识别新冠病毒的S基因,另一种识别Orf1ab基因。当与Cas13蛋白结合时,它们可形成一个SHERLOCK系统,检测病毒RNA的存在。为提高检测的准确率,研究团队选择了新型冠状病毒最具特异性的序列,以降低其他呼吸道病毒基因组的干扰。最终,研究团队成功开发出适用于新型冠状病毒RNA的检测方法。
该检测方案包括三个步骤,适用于为qPCR检测提取的RNA样本:
1. 将提取的RNA进行等温扩增反应,42°C下孵育25分钟;

2. 步骤1反应物加入Cas13蛋白、向导RNA和报告分子,37°C孵育30分钟;

3. 将试纸条浸入步骤2的反应体系中,反应需2分钟。

研究团队设计的向导RNA能精准识别样本中的新型冠状病毒RNA,并激活与其结合的Cas13a蛋白,使得Cas13a疯狂切开它所遇到的任何其他RNA分子。同时,研究人员还添加了一种通过RNA相连接的报告分子。一旦激活Cas13a,这种报告分子连接的RNA就会被切断。因此,通过报告分子是否被切断,就能判断检测COVID-19患者样本中新冠病毒的存在与否。

图:不同新型冠状病毒RNA浓度的检测图像。

如果COVID-19患者样本中不存在新冠病毒,试纸标识“完整分子”的较低位置上,就会出现一个条带;如果样本中存在新冠病毒的RNA,在标识“切断分子”的较高位置上,会出现另一个条带。通过条带位置的不同,很容易确认是否存在新型冠状病毒。在试验中,该方法可稳定检测出新冠病毒的RNA序列,且灵敏度较高,每微升里仅需100个拷贝甚至10个拷贝。
研究团队表示,该检测方法仍需进一步的优化、测试和临床验证,以开发出用于检测COVID-19患者样本中新型冠状病毒的简单系统。同时,研究团队将免费提供可能有用的信息,包括共享可能支持潜在诊断开发的信息。将为任何有兴趣进一步开发和使用此技术的组织免费提供技术支持(https://www.addgene.org/91909/,或sherlock@broadinstitute.org),包括开发含Cas13蛋白的启动试剂盒、向导RNA、报告分子和等温扩增引物。
参考资料:
1.A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics
https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd1703a3da4d3/t/5e46d16cf617da2f796f926e/1581699437272/COVID-19+detection+%28v20200214%29.pdf
2. Enabling coronavirus detection using CRISPR-Cas13: An open-access SHERLOCK research protocol
https://mcgovern.mit.edu/2020/02/14/enabling-coronavirus-detection-using-crispr-cas13-an-open-access-sherlock-research-protocol/
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本文由 测序中国 作者:戴胜 发表,转载请注明来源!

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