无创产前筛查（NIPT）目前已被推荐作为常见染色体异常（如21-三体、18-三体、13-三体）的一线筛查方法，超越了传统筛查方法。NIPT也可用于性染色体非整倍体和选择的微缺失/微重复综合征（MMS）筛查。相比之下，单基因疾病的无创产前筛查（NIPT-M）的发展速度较慢。通常NIPT-M可以在7周内获得可靠的胎儿游离DNA（cffDNA）水平，为妊娠管理和决策提供关键的额外时间。但现有的NIPT-M方法通常需要专门的设计，局限于狭窄的基因范围，或者实际临床应用价格昂贵。为此，上海交通大学李淑元、王剑、王彦林团队提出了一种通用的基于单倍型的NIPT-M方法HaploNIPD，使用了包括120,000个选定的单核苷酸多态性（SNP）的靶向捕获panel。研究团队对来自家庭成员的母体游离DNA（cfDNA）以及基因组DNA（gDNA）进行了靶向捕获，并对这些样本进行了大规模的并行测序分析，并通过70个单基因疾病家族和152个已知胎儿核型样本评估了HaploNIPD的可行性。

HaploNIPD的设计克服了现有panel主要集中于单个或有限数量的基因以及缺乏普遍可用性的局限性。研究团队开发了专门为中国人群量身定制的具有成本效益的全基因组SNP panel。利用1000基因组计划（北京汉族），研究选择了次等位基因频率在30%-70%之间，GC含量在30%-70%之间（侧翼120bp），可映射性>0.85的SNP。通过增加1148个靶基因上下游2Mb内SNP采样概率，进一步提高了临床相关区域的分辨率，平均每个基因237.4个SNP，每条染色体50个基因（图1）。靶基因的选择基于OMIM数据库、新生儿遗传筛选panel、相关文献和本地数据库等，重点选择与相对常见遗传疾病相关的基因。最终的panel由大约12万个位点组成。

2019年10月至2024年12月，研究团队从上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院（IPMCH）招募了70个中国单基因疾病风险家庭，采集了孕妇、父亲、先证者或其他可用家庭成员的外周血（~10ml）。HaploNIPD分析使用的样本包括从母亲血浆中提取的cfDNA，以及来自父亲、受试者或其他家庭成员的gDNA。cfDNA文库捕获后在DNBSEQ-T7测序平台上进行150-bp的双端测序。所有胎儿都使用从绒毛膜绒毛（CV）或羊水（AF）样本中提取的DNA进行了传统的有创产前诊断（IPD）。IPD结果直接报告给患者进行妊娠管理，并作为HaploNIPD评估的基准。

研究还对CV或AF样本的胎儿DNA进行了靶捕获测序，以全面验证HaploNIPD的性能。为了进一步评估HaploNIPD在检测非整倍体和拷贝数变异（CNV）方面的性能，研究团队分析了14例确诊胎儿非整倍体、8例MMS和130例正常核型的孕妇血浆样本，包括上述70例单基因高危病例。

图1.HaploNIPD的panel特点

HaploNIPD采用两种策略构建亲本单倍型：先证者辅助单倍型phasing（PAHP）和相对辅助单倍型phasing（RAHP）。结果显示，PAHP和RAHP分别推断出54个亲本单倍型和16个亲本单倍型。在70个已知单基因疾病家族中，有69个（98.57%）成功推断出胎儿在相关变异位点的单倍型，且结果与IPD一致。其中Fam8的胎儿中发现了母体GJB2基因区域的重组，这使确定胎儿是正常的还是母体致病等位基因携带者具有不确定性。

研究团队以Fam10（PAHP模式）和Fam6（RAHP模式）为例，cfDNA单倍型分析显示，父亲的单倍型片段与野生型等位基因关联，而母亲的单倍型片段与突变型等位基因关联，这说明该胎儿携带了母亲的致病等位基因（图2B）。

图2.胎儿单倍型的无创推断。

研究团队综合评价了HaploNIPD的全基因组单倍型准确性，使用相同的靶向捕获panel比较了从母体血浆中推断的胎儿单倍型与从CV/AF胎儿基因DNA获得的胎儿单倍型，发现父系单倍型一直表现出很高的准确性，在整个基因组中平均为99.74%，母系单倍型略低，平均为98.23%（图3A）。胎儿分数显著影响母亲单倍型准确性，但不影响父亲单倍型准确性。

以胎儿gDNA为参照，基于cfDNA的重组检测对亲本单倍型的敏感性均达到100%，父本单倍型的特异性为96.1%，母本单倍型的特异性为85.6%。重组区域的单倍型准确性明显低于非重组区域，尤其是母体的单倍型（图3A）。

图3.从母体血浆推断胎儿单倍型的准确性。

为了最大限度地减少低胎儿分数和重组的影响，研究人员根据重组状态和胎儿分数建立了信息SNP（iSNP）数量的最小阈值。在非重组区域，除了母体的单倍型在胎儿分数<5%外，双亲起源的单倍型准确性是稳定的，并且通常不受iSNP计数的影响（图4A）。在重组区，父系单倍型需要≥10个iSNP才能达到95%的准确率。对于母体单倍型，胎儿分数≥15%时的阈值为≥10个iSNP，胎儿分数10-15%时为≥20个，胎儿分数5-10%时为≥30个；当胎儿分数<5%时，准确率一般<95%（图4B）。研究将胎儿分数低于5%的样本或重组间隔中目标区域缺乏足够iSNP的样本指定为“no-call”，排除no-call区域显著提高了整体精度（图4C）。

图4.iSNP数量对单倍型准确性的影响及no-call过滤后的改进。

有单基因疾病风险的家庭需要同时筛查非整倍体和MMS，因此，研究团队利用HaploNIPD分析了152例母体血浆样本，包括130例正常核型（61例女胎和69例男胎）、14例非整倍体和8例MMS。

结果显示，所有常见的非整倍体（13、18和21三体，X、XXX、XXY和XYY单体）和MMS均被准确鉴定，与IPD结果一致。67例正常男胎被正确归类为Y染色体非整倍体低风险（图5B）。1例XXY患者的Z评分为3.82，R值为0.64；1例XYY患者的Z评分为4.91，R值为2.24，均被正确识别为高危个体。该分析无假阳性或假阴性结果，HaploNIPD检测胎儿非整倍体的灵敏度为100%，特异性为100%。

对于MMS筛选，所有8个具有致病性CNV的胎儿都可被重复检测，结果灵敏度为100%。其中假阳性主要见于较小的CNV。CNV≥10Mb的阳性预测值（PPV）为100.0%，4-10Mb的阳性预测值为33.33%，特异性分别为100%和95.56%。

图5.HaploNIPD检测胎儿染色体非整倍体。

研究团队成功开发了一种新颖、通用的NIPT-M方法HaploNIPD。通过对70个已知单基因疾病家族和152个已知核型的血浆样本分析，证明HaploNIPD能够准确进行全基因组胎儿单倍型分析，同时检测常见的非整倍体和MMS。

与现有NIPT-M方法不同，HaploNIPD采用全基因组单倍型分析方法，重点关注了中国人群中1148个携带者变异频率高或疾病患病率高的基因。重要的是，HaploNIPD可以推断出几乎所有致病基因的胎儿基因型，而不考虑是否包含在panel内，从而消除了基因位点特异性设计的需要，降低了技术复杂性。与依赖全基因组测序或微流体的全基因组NIPT-M策略相比，HaploNIPD的靶标捕获方法提高了成本效益。文章显示，HaploNIPD分析的总成本约为每个家族330美元，其中探针130美元，文库制备170美元，测序成本30美元，总周转时间为7-10天，可及时做出临床决策。

总体而言，HaploNIPD作为一种经济、省时的解决方案，为高危人群的早孕提供了一种全面、综合的基因检测策略，有助于对高危妊娠进行早期、无创遗传评估，支持及时的临床决策。

该研究参与者的基因变异和关键表型已提交到ClinVar数据库：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/submitters/510010/

该研究使用的定制计算代码可在Github获得：

https://github.com/YimingWoo/HaploNIPD

原文信息：

Zhang, L., Hua, R., Wu, Y. et al. Universal noninvasive prenatal diagnosis for monogenic disorders using cell-free plasma DNA. Genome Med (2025). https://doi.org/10.1186/s13073-025-01588-5