近日，2020年诺贝尔化学奖得主Jennifer A. Doudna教授团队在Nature Biotechnology发文报道了活细胞RNA单分子成像的最新突破性进展，首次实现了对活细胞中天然RNA的单分子实时追踪。

作为CRISPR基因编辑技术先驱 ，Doudna教授领导团队创新的将可编程RNA引导、RNA靶向CRISPR-Csm系统与多路gRNA相结合，开发了单分子活细胞荧光原位杂交方法（smLiveFISH），用于直接、高效地可视化一系列细胞类型（包括原代细胞）中任何未修饰的内源性单个mRNA分子。研究表明，smLiveFISH有可能帮助解析控制健康和疾病中天然转录本时空组织的原理。

虽然来自不同类型CRISPR-Cas系统（例如RCas9、dCas13、dCsm）已被用于标记活细胞中的靶标RNA。但这些方法尚未达到单分子分辨率，因为每个RNA都有一个单一的crRNA靶向，这导致自由RNA和靶向RNA之间的荧光强度相似。只有RNA granules或具有重复序列的RNA才能从结合RNPs的多个拷贝中产生足够信号，这与非特异性结合或背景信号是有区别的。

为了克服信噪比问题，Doudna团队从smFISH中获得了灵感。研究团队推断，如果荧光标记的RNA可以同时沿着靶RNA平铺，那么活细胞中内源性RNA的单分子成像是可能的（图1a）。通过多次比较分析，研究团队最终选择来自嗜热链球菌的RNA靶向III-A型CRISPR-Csm系统和多导RNA，设计了靶向RNA的crRNA探针阵列，结合多荧光标记Csm复合物（每个复合体携带≥3个GFP标记），成功开发了活细胞RNA单分子成像方法smLiveFISH，用于追踪不同类型活细胞中的单个mRNA分子。

图1.天然mRNA单分子的smLiveFISH成像。a：smLiveFISH系统的原理图。b：左图为GFP标记的Csm复合物和48个NOTCH2靶向crRNA标记的单个NOTCH2 mRNA的固定细胞图像；中图为smFISH探针标记的单个NOTCH2 mRNA图像；右图为重叠图。c：b图中黄色框区域的放大图。d：Csm复合foci与smFISH foci共定位的百分比。e：Csm复合物标记foci的转染细胞百分比。

为了验证smLiveFISH方法，研究团队利用其在活细胞中追踪了两种不同mRNA：NOTCH2和MAP1B。研究发现NOTCH2 mRNA包括两个种群，它们具有不同的动态，与内质网的共翻译易位相关。与之相反，MAP1B mRNA表现出几种不同的行为，包括MAP1B mRNA向细胞外周的定向转运，并且其定向转运不依赖于翻译。

在NOTCH2的分析中，成像结果显示，Csm标记与smFISH点强共定位，表明GFP标记的Csm复合物成功标记了内源性NOTCH2 mRNA。定量分析显示85%的Csm标记与smFISH点共定位。此外，将smLiveFISH应用于其他细胞系，包括HEK293T、HeLa、原代人成纤维细胞IMR-90和非洲绿猴COS-7，在所有细胞类型中都发现了内源性NOTCH2 mRNA的强大信号。

图2.活细胞中单个NOTCH2 mRNA的动态。

MAP1B具有不同于NOTCH2 mRNA的空间定位模式。研究团队使用GFP荧光检测在细胞质中观察到单分子点，并观察到Csm标记与smFISH点有很强的共定位。使用smLiveFISH，研究进一步分析了标记RNA种类的空间分布，发现MAP1B mRNA在细胞外周富集，而NOTCH2 mRNA在核周区域富集，这与此前固定细胞中的RNA FISH结果一致。

图3.活细胞中单个MAP1B mRNA的动态。

在活细胞成像中，研究发现MAP1B mrna向细胞边缘的线性运输，在此基础上它们保持相对静止，这与NOTCH2不同。虽然MAP1B mRNA偶尔向后面的细胞核方向移动，但最终再次向细胞边缘移动。

此外，进一步分析表明，smLiveFISH可以检测到响应小分子的单转录本定位的差异，例如整合到p -小体中，强调了评估单个内源性RNA行为的实用性。

论文原文：

Xia, C., Colognori, D., Jiang, X.S. et al. Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm. Nat Biotechnol (2025). https://doi.org/10.1038/s41587-024-02540-5