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干货分享 | 系统比较多种单细胞RNA测序平台性能,七大平台各有所长

自2009年以来,单细胞RNA测序一直是推动生物医学研究进步的重要动力。越来越多的单细胞RNA测序平台被应用于科研和临床。对于大规模的单细胞RNA测序研究来说,一个主要的技术障碍是高通量和灵敏度,还要考虑成本问题。随着低成本、高通量的液滴单细胞RNA测序平台的推出,研究人员在单细胞研究中有了更多的选择,但现有的平台性能如何?科研人员又该如何选择?

为帮助研究人员根据自身需求选择最适合单细胞RNA测序平台。部分国内外科学家对已有平台进行了系统的性能比较,今年4月,生物分子资源设施协会(ABRF)公布了四种单细胞RNA测序平台Fluidigm、WaferGen、10X Chromium Controlle和Illumina/Bio-Rad测序平台的性能差异。11月,中国北京大学黄岩谊研究组、清华大学王建斌研究组等研究人员,联合发表了三种基于液滴的单细胞RNA测序平台10X Genomics Chromium、inDrop和Drop-seq的性能比较结果。两项独立研究结果均显示,没有一种平台可以很好的满足用户的所有需求,各个平台均有优缺点以及各自的应用范围。

研究一:10X Genomics Chromium、inDrop、Drop-seq性能比较

黄岩谊、王建斌的联合研究成果已发表在Molecular Cell。研究人员利用同一个淋巴母细胞系,对常用的三种基于液滴的超高通量单细胞RNA测序平台10X Genomics Chromium和inDrop、Drop-seq进行了性能比较,每种平台进行2~3个重复检测。同时,他们还开发了可适用于三个分析平台的生物信息分析框架。研究团队表示,研究开始时BioRad的ddSeq平台尚未推出,所以未包括在内。

图1. 研究概要

研究团队表示,该研究中的单细胞RNA测序平台各有优缺点,并适用于不同应用。总体来说,10X Genomics的Chromium系统比Drop-seq或inDrop表现更强大,其技术噪音最小,稳定性最高。

图3. 三个平台实验特征示意图及比较

该研究发现,基因表达聚类与分析使用的平台有关,表明存在基因水平的系统特异性量化偏差。研究人员仔细分析了每个平台中偏差的来源,发现Chromium平台偏爱较短的序列和GC含量较高的序列,而Drop-seq对GC含量较低的基因检测效果较好。

分析结果显示,三个平台在重复性方面都是一致的,表明在同一平台上可以合并来自多个实验的检测数据。但比较不同平台产生的数据仍非常有挑战性,为此,研究团队开发了可适用于三个分析平台的数据分析框架,方便数据比较。

图4. 左:各平台检测性能;右:各平台技术噪音。

在该研究中,就性能而言,10X Genomics的灵敏度最高,可在3000个基因中平均捕获17000个转录组;Drot-seq检测到2500个基因的8000个转录组;InDrop可检测到1250个基因的2700个转录组。灵敏度高的一个好处就是可以通过较少的reads获取相同级别的分子标记。此外,10X Genomics平台的噪音也最少。研究人员认为,inDrop平台噪音的一个来源是微珠的易变性,因为研究中出现了两批微珠检测同一样本的结果完全不同的情况。

该研究还意外发现了不同微珠对检测结果的影响。研究中的三个平台都在微珠上附加了条形码。为了确保一个细胞对应一个条形码,微珠和细胞都需要进行稀释。但微珠自身可能会影响稀释效果,进而影响细胞的捕获效率。例如,10X Genomics和inDrop都使用水凝胶珠,它们体积大、柔软灵活,流经系统的速度较低,能够避免两个细胞或两个微珠被包裹在一个水滴中,因此只需要较小的稀释就能获得较高的捕获效率。Drop-seq使用的微珠更小更硬,需要更大的稀释度避免微珠成对出现,但这会降低细胞捕获效率。

此外,检测结果表明,10X Genomics微珠的条形码错配较少,另外两个平台有超过一半的细胞条形码出现明显的错配。其中,Drop-seq约10%微珠的条形码出现一个碱基缺失。

转录组检测的试验成本和效率取决于具体场景。为方便研究人员选择合适的单细胞RNA测序平台进行研究,研究团队针对三个平台的表现与特性给出了指导意见。虽然大多数项目的细胞数量相对较多,但对于稀少样本,如人类胚胎,需要细胞捕获效率更高的平台,10X Genomics是较为合适的选择。但在三款平台中,10X Genomics的成本最高,定价为125000美元,仅运行单细胞实验的平台为75000美元,估计每个细胞的检测成本为0.50美元。

Drop-seq平台是较便宜的一个选择。Drop-seq平台制造成本为6000美元,购买花费不到30000美元,每个细胞的检测成本为0.10美元。但目前国内使用Drop-seq的成本明显高于国外。由于细胞捕获效率较低,Drop-seq平台适合样本丰富的研究,不太适合用于少量样本和珍贵样本的检测。

当低丰度转录组的检测可选择时,选择inDrop更合适。研究团队估计inDrop仪器成本约为50000美元,每个细胞检测成本为0.25美元。InDrop的主要优势是开放系统,用户可以根据自己的需求对其进行调整和定制。研究人员表示,inDrop还没有10X Genomics平台那么强大,但预计它会不断改善。总体来说,这三个平台都能提供令人满意的检测效率。

研究二:Fluidigm、WaferGen、10X Chromium Controller、Illumina/Bio-Rad平台性能比较

ABRF研究小组针对一组经治疗和未经治疗的乳腺癌细胞系比较了Fluidigm、WaferGen、10X Chromium Controller和Illumina/Bio-Rad测序平台在易用性、成本和时间方面的差异。

在捕获能力方面,Fluidigm平台具有较低的细胞捕获能力,该平台最高捕获400个细胞。除Fluidigm外,其他平台的捕获能力约为单臂4000个细胞。在捕获效率方面,不同单细胞测序平台的表现不尽相同,如10X Chromium Controller平台的捕获效率为65%,WaferGen平台为30%,而Illumina / BioRad平台的效率仅为3%。但每个单细胞RNA测序平台都可以区分已治疗和未经治疗的癌细胞,只是有些平台更具有特异性,有些平台更加适合处理解决治疗组的相关问题。

就基因检测结果而言,各检测平台在测试条件下具有相似的灵敏度。其中,Fluidigm平台的表现稍好,其他平台则差异不大。此外,研究人员发现这些平台都非常擅长检测低表达的基因。这四种平台也存在一些系统特异性偏差,尤其在GC含量和基因长度方面。这与黄岩谊等人的研究结果相似。

该研究结果显示,不同单细胞RNA测序平台在易用性和周转时间方面也各不相同。根据报告,10X Chromium Controller和Illumina / BioRad平台更易于操作人员使用,但Fluidigm HT则被认为使用较为困难。此外,Fluidigm HT-IFC平台的耗时为12小时,时间最长;Fluidigm 96 IFC、Illumina / BioRad和10X Chromium Controller平台耗时均约为10小时,相比之下,WaferGen仅用7小时。

ABRF研究小组也做了成本分析。Fluidigm HT-IFC方法从细胞捕获到测序需花费2500美元,每个细胞花费在3.13美元到6.25美元之间,96 IFC方法则花费2000美元,即每个细胞20.83美元;Illumina / BioRad每个细胞花费1~4美元;WaferGen每个细胞约花费3美元;10X Chromium Controller每个细胞花费0.15~1.50美元。

由于测序平台的性能各不相同,所以在不同测序试验中选择使用什么平台非常重要。实验人员在选择测序平台时需要根据实际情况考虑多种因素,以选择一种最能满足试验需求的平台。

参考资料:

1. Comparative Analysis of Droplet-Based Ultra-HighThroughput Single-Cell RNA-Seq Systems

2. Study Finds No One Size Fits All for Single-Cell RNA Sequencing

3. 四种单细胞RNA测序平台“比拼”,按需选择才是“王道”

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本文由 测序中国 作者:王迪 发表,转载请注明来源!

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