二代测序（NGS）的快速发展加速了遗传病、癌症等领域的研究，其本身也作为一种更为先进的基因检测手段逐步走进临床。在NGS的众多技术中，靶向测序正在成为新时代的“宠儿”。遗传病诊断（WES/Panel）、肿瘤伴随诊断(肿瘤多基因Panel)、免疫治疗疗效预测（WES/Panel），这些NGS应用热点都是靶向测序打下的“江山”。今天，咱们不谈常规操作，让小编给大家分享一些靶向测序的其他用途。

图1：外显子测序被广泛应用于遗传病和癌症研究

HPV感染是宫颈癌的重要致病因素。在全世界范围内，每年有近50万宫颈癌新发病例，我国占了近三成。此前研究表明，99%的宫颈癌患者都存在HPV感染，备受关注的HPV疫苗正是针对了这个靶点。但绝大多数HPV感染都是一过性的，极少一部分感染者会最终发展成为宫颈癌。

研究人员发现，从HPV感染到癌变的过程中，有些HPV病毒基因会“嵌入”（整合）到人体细胞的基因组中，整合事件的发生和癌变结局有着一定的相关性，可以进一步作为分子标志区分高危人群。如何检测这些入侵人类基因组的HPV呢？2015年，我国学者创造性地借助靶向测序来探究人类基因组上HPV的整合热点和可能的整合机制。该研究发表在《自然-遗传学》上，堪称靶向测序应用的经典之作 [1]。

图2. 捕获测序用以探究HPV整合位点的原理示意图

如图2所示，根据HPV基因组序列设计探针，从感染细胞中捕获HPV基因组，如果有整合发生，测序Reads中将同时存在HPV和人类基因组的序列，与参考基因组比对，便可获得整合位置的信息。在利用细胞系样品进行的性能验证中，靶向测序较WGS更加灵敏，不但可以鉴定到WGS发现的绝大部分整合位点（10/11），还额外检测到135个WGS没有检出的位点。HPV的整合热点可以作为宫颈癌患者早期个性化治疗和进展评估的重要分子标志物。

伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）以蜱为主要传播媒介，感染人体后会引起以神经系统损伤为主的莱姆病，据说红极一时的摇滚歌手艾薇儿就因患此病退出歌坛多年。从宿主中快速而准确地检测人类病原体的全基因组序列，将有助于对病原体的流行病学和进化动力学进行精细解析研究。但是，在提取DNA之前较难事先分离宿主细胞和病原体，宿主基因组将造成大量的数据浪费。以伯氏疏螺旋体为例，它的基因组大小约为0.0015 Gb，而其宿主蜱虫的基因组长约2.1Gb，如果采用WGS进行研究，伯氏疏螺旋体的有效数据可能只有可怜的千分之一（基因拷贝：1:1）。2015年，有研究利用基于杂交捕获的靶向测序技术富集蜱虫体内的伯氏疏螺旋体基因组，数据有效率在70%以上（Roche SeqCap EZ Choice，[2]）。

传染病的病原体鉴定，细菌耐药谱分析是NGS在临床中的重要应用方向。2013年《新英格兰医学杂志》发表的一篇报道中，应用全基因组测序，可以将结核分枝杆菌耐药谱检测时间从几个星期缩短到几天，但昂贵的成本和检测灵敏度限制了该方法的广泛应用[3]。面对这些挑战，我们来看看捕获测序的表现。VirCapSeq-VERT技术是针对病毒基因的NGS靶向检测方法，它包含约200万条长度为100nt的探针（Roche SeqCap EZ Choice），可在血清、血液和组织等复杂的样本背景下，检测207种已知脊椎动物病毒[4]。相对于传统的NGS技术，VirCapSeq-VERT得到的Reads深度可提高100~10000倍。此外，还有前段时间报道的BacCapSeq技术，可靶向检测细菌基因组。该系统包括420万条长约75nt的探针（Roche SeqCap EZ Choice），能够一次性检测307种细菌，包括所有已知致病菌，抗生素耐药基因和毒力因子，其准确性与针对性细菌筛查相当，而且检测范围更广。要知道，多重PCR一次最多检测19种致病菌。此外，BacCapSeq技术还更加灵敏（富集1000倍），并且可以在70小时内完成抗生素耐药性检测[5]。除应用于病毒和细菌外，靶向测序技术也适用于线粒体DNA的突变检测。

图3. 靶向测序技术用于病原体基因检测

目前，基于NGS的NIPT技术已被应用于检测非整倍体（唐氏综合征等）的临床筛查。在科研中，单基因遗传病的无创产前检测（NIPD）在近年也获得了较大进展，其中最具代表性案列，是对可及时治疗的先天性肾上腺皮质增生的诊断。该技术以相对单倍型剂量（Relative Haplotype Dosage，RHDO）为原理，通过靶向测序实现。

NIPD的检测难点主要是在母亲作为携带者的情况，在孕妇的游离DNA中，母体基因型片段占据绝大部分，只通过变异位点本身的频率很难准确评估胎儿的基因型。RHDO通过成百上千个“等位基因关联的SNP”来提高准确性，并将胎儿基因型预测简化为判断胎儿遗传了父母双方的某种单倍型。此外，由于RHDO并不是直接检测突变本身，所以，无论致病变异是点突变还是大片段缺失，RHDO均可胜任。如图4所示，在α和β地贫的无创产前诊断研究中，先获得父母双方的单倍型信息，并对等位基因关联的单倍型区域设计探针（Roche SeqCap EZ Choice），然后对相应区域的cfDNA进行捕获测序，富集单倍型区域，统计关联SNP的频率，评估整个单倍型区域的相对剂量，最后以此预测胎儿基因型。

图4.相对单倍型剂量的检测原理以及应用于地中海贫血的无创产前诊断

拷贝数变异（CNV）是一种重要的人类基因组变异，它会导致常见的遗传疾病，如自闭症、智力障碍和精神分裂症等。CMA（CNV）配合WES（SNV、InDel）被认为是遗传病分子诊断中性价比最高的组合[6、7]。如果外显子测序也具备检测CNV的能力，将进一步拓展靶向测序的应用场景。现在，研究人员已经开发了大量的方法来利用外显子测序数据分析CNV，例如，通过外显子区域的深度或Off-target Reads进行，但还是存在一些局限性，比如分析区域受限、假阳性高、灵敏度低等。近年来，相关的改进都是基于算法的优化，今年已经有研究从技术层面入手，通过在WES 探针集中掺入均匀分布于基因组的探针，尝试从数据源头解决这些问题[11]，该方法的具体表现如何我们日后再和大家分享。

1. GWAS 2.0

基于芯片的GWAS可以发现复杂疾病显著关联的变异位点，但多在非编码区，很难真正确定致病根源。基于外显子测序的GWAS则可以将关联变异位点锁定在编码区内，能够为致病机制的阐明，疾病的治疗提供更丰富的线索。

2. 新的身份：多基因高通量检测的“金标准”

WES被认为是遗传病致病基因发现的重要武器之一，Sanger测序则是作为确认WES结果的金标准。而现在，这种情况在悄然转变。有研究表明，对某些基因的测序结果中，高质量的靶向测序结果与金标准Sanger的准确性已经旗鼓相当[8]。在一些研究中，利用Panel或Sanger测序找到了候选致病基因后，WES（Roche SeqCap EZ Exome V2.0）被用于排除其他基因突变致病的可能性（图5）。时至今日，外显子测序不再单单作为鉴定新致病基因的筛选方法，而是逐步向多区域、多基因高通量检测的“金标准”迈进，肿瘤多基因Panel的接连获批也正印证了这一点。

图5. WES被用于排除候选基因外的其他基因突变致病的可能性[9,10]

3. 肿瘤新抗原预测

去年，继PD-1/PD-L1抗体、CAR-T细胞治疗之后，“个性化肿瘤疫苗”在临床治疗上也取得的重大突破。通过对肿瘤细胞进行WES和RNA-seq，筛选肿瘤细胞特异表达的突变基因，可以为“个性化肿瘤疫苗”的肿瘤新抗原预测提供蓝图，所以，准确的鉴定肿瘤基因突变是“个性化肿瘤疫苗”成功的基础。

靶向测序的核心优势在于性价比高，但不论是低频突变检测还是病原体鉴定，靶向测序所展现出的高灵敏性，更多的是成本优势的间接反映，这些任务WGS都可以完成，只不过成本过高。值得注意的是，靶向测序的性价比仍有提升空间。

一方面，在完成概念验证或数据积累后，可以进一步精简靶向测序的目标区间，压缩测序成本；例如，在检测TMB方面，肿瘤多基因Panel已经被证明与WES具有较高的一致性。在遗传病基因诊断方面，耳聋、癫痫等多基因Panel也有很高的诊断率。当然，Panel和WES都有自己的优缺点，也有各自的应用场景，Panel更加灵活，可以根据不断更新的数据库，及时添加相关位点，例如一些内含子区域；WES多为商业化试剂盒，往往很难做快速更新换代，所以将“与时俱进”的Panel和商业化WES一起比较并不十分客观。而在应用于表型复杂的疑似遗传病诊断，发现新基因以及重分析时，WES更具优势。另一个方面，进一步丰富靶向测序的突变检测范围，使之能够同时检测基因组SNV、InDel、CNV并覆盖线粒体DNA，将有助于提升其成本效益。

参考文献

1. Genome-wide profiling of HPV integration in cervical cancer identifies clustered genomic hot spots and a potential microhomology-mediated integration mechanism. 2015 Nature Genetics

2. Whole genome capture of vector-borne pathogens from mixed DNA samples: a case study of Borrelia burgdorferi. 2015 BMC Genomics

3. Whole-genome sequencing for rapid susceptibility testing of M. tuberculosis. 2013 NEJM

4. Virome Capture Sequencing Enables Sensitive Viral Diagnosis and Comprehensive Virome Analysis. 2015 mBio

5. BacCapSeq: a Platform for Diagnosis and Characterization of Bacterial Infections. 2018 mBio

6. Molecular Diagnostic Yield of Chromosomal Microarray Analysis and Whole-Exome Sequencing in Children With Autism Spectrum Disorder. 2015 JAMA

7. Genomic diagnostics within a medically underserved population: efficacy and implications. 2017 GENETICS in MEDICINE

8. Beck TF, Mullikin JC. Systematic evaluation of Sanger validation of next-generation sequencing variants. 2016 Clin Chem

9. Modifier variant of METTL13 suppresses human GAB1–associated profound deafness,2018 JCI

10. A C-terminal nonsense mutation links PTPRQ with autosomal-dominant hearing loss, DFNA73. 2018 GENETICS in MEDICINE

11. CoDE-seq, an augmented whole-exome sequencing, enables the accurate detection of CNVs and mutations in Mendelian obesity and intellectual disability. 2018 MOLECULAR METABOLISM