在过去的二十年中，为更好、更全面地了解癌症等疾病，科学家在表观遗传学领域进行了深入研究，而用于破译表观遗传密码的主要方法便是亚硫酸氢盐测序（BSseq）。但遗憾的是，BSseq虽然帮助科学家在表观遗传学领域取得了长足的进步，但其自身的局限性也使很多研究陷入了瓶颈。例如，BSseq无法区分DNA构建块（building block）胞嘧啶上最常见的修饰，而且最让研究人员头疼的就是亚硫酸氢盐会破坏DNA样本，使DNA过度降解。为避免以上问题，在5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的检测中，很多研究已经不再使用BSseq方法，而是借助纳米孔测序、单分子实时测序（SMRT）以及基于限制酶的测序方法。然而，以上每种方法都因其局限性产生了相互矛盾的检测结果，例如，非CG中5hmC的富集就是一个备受争论的焦点。

为解决化学脱氨的限制，科学家开始寻求更优的脱氨方式。来自美国宾夕法尼亚大学的研究人员便注意到了AID/APOBEC家族DNA脱氨酶的酶促脱氨作用。这种脱氨反应可以实现亚硫酸氢盐的作用，且不会损伤DNA。基于此，研究人员开发了一种全新的表观遗传测序方法ACE-seq（APOBEC-coupled epigenetic sequencing），而无需亚硫酸氢盐，可在单碱基分辨率条件下进行5hmC的检测定位，获得高置信度的5hmC图谱。更重要的是，该方法所需DNA样本量比目前的金标准技术少1000倍！2018年10月9日，该研究结果发表在国际顶级学术期刊Nature Biotechnology上，文章题为“Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase”。

ACE-seq方法使用的是一种被称为“APOBEC”的脱氨酶。该脱氨酶可以在有效区分不同胞嘧啶修饰状态的同时，避免损伤DNA。经验证，该方法对胞嘧啶修饰状态的识别性能与亚硫酸氢盐相似。ACE-seq的一个重要特性就是能够稳定的从胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶（5mC）中区分5hmC，这使得5hmC的高可信度分析成为可能。研究人员利用ACE-seq方法在组织来源的皮质兴奋性神经元中，生成了5hmC单碱基分辨率图谱，并发现5hmC几乎完全局限于CG二核苷酸。通过分析5mC和5hmC的单碱基分辨率图谱，他们发现那些在BSseq中看起来完全甲基化的基因位点在5hmC和5mC分布方面有着显著的不同。

图1. 胞嘧啶修饰在不同测序方法中的反应。a. ACE-seq的脱氨作用与BS-seq产生的效果相当。b. ACE-seq借助APOBEC3A催化C和5mC的脱氨作用完成。

通过分析获得的基因组图谱，研究人员对胞嘧啶、5mC和5hmC进行了详尽的解析，发现在各种基因调控元件和基因组特征中，5hmC的水平通常低于5mC的水平。值得注意的是，在许多基因组特征中5hmC/5mC比率几乎保持恒定，如在启动子-远端增强子中，5hmC水平几乎等于5mC（5hmC/5mC比率为0.90），而不是像整体基因组特征趋势所预期那样按比例降低。

图2. 使用ACE-seq检测几类基因组元件中5hmCG（蓝色）和5mCG（红色）的修饰水平，红色虚线表5mCG非转换率。

此外，研究人员还关注了印记调控区（ICR）中的30个差异甲基化区域（DMRs），发现其平均5hmC水平（6.7%）远低于基因组的基线水平，甚至低于预期的5mC水平（5hmC/5mC比率0.17）。其中大多数DMRs表现出独特的5hmC/5mC模式，其中22个显示5hmC水平<10％，5hmC/5mC比率平均为0.08。

表观遗传修饰会对DNA中的碱基进行标记，以此控制DNA中某些基因的沉默与表达，进而导致疾病的发生。因此，表观遗传修饰在癌症等疾病研究中是一种非常有价值的诊断和预后工具。为了能在高精确度下更早检测疾病的发生发展，科学家越来越关注样本中有限的游离DNA，如血液中的cfDNA的表观遗传修饰。研究人员表示，希望借助ACE-seq方法解码此前难以研究的细胞群DNA的表观遗传标记，以确定目标DNA是来自特定组织还是肿瘤。

ACE-seq克服了已使用数十年的亚硫酸氢盐测序方法带来的许多挑战，扩大了表观基因组分析的范围。此外，ACE-seq具有分析来自更罕见样本DNA的潜力，例如早期发育中的DNA或cfDNA样本。该研究开启了关于胞嘧啶修饰在基因组中生物学作用的新探索，为更好地理解复杂生物过程，如神经系统、肿瘤的发展开辟了新的道路，也为表观遗传测序技术的改进提供了新的思路。