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测序周报 · 科研篇:非编码RNA真的不编码吗?9张图告诉你答案

非编码RNA真的不编码吗?9张图告诉你答案

近期,Molecular Cell和Cell Research刊登了三篇有关环状RNA具有翻译能力的研究,可谓一石激起千层浪,打破了传统的环状RNA是非编码RNA的概念,进一步拓展了环状RNA的功能,丰富了蛋白质组的组成,意义重大。由此,我们不禁要问,其他的非编码RNA,特别是长非编码RNA,拥有与mRNA类似的结构和小的开放阅读框,是否也具有编码的能力呢?有趣的是,虽然长非编码RNA一经鉴定出来就被定义为非编码RNA,但是关于它们编码潜能的探索,却没有停止。

小编将通过9幅图,给大家梳理环状RNA和长非编码RNA翻译能力的研究进展。需要注意的是,虽然已有个别非编码RNA被实验证明可以翻译出小肽,有大量非编码RNA被生物信息学预测可以翻译出小肽,但也有研究发现,绝大部分非编码RNA即使结合在核糖体上,也仍然是不翻译的。这两个阵营的研究都在9幅图里,希望帮大家快速了解有关非编码RNA的编码研究。

中国科学院王泽峰研究员在Cell Research上发表题为《Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine》的研究论文,发现环状RNA上的甲基化修饰m6A可以驱动非帽依赖性的翻译机制来合成蛋白质。RNA m6A修饰是近年来RNA表观遗传学的研究热点,越来越多的研究发现m6A与胚胎发育和疾病,特别是肿瘤,都密切相关。RNA m6A的研究多集中在mRNA上,可影响mRNA的翻译效率和稳定性,而环状RNA上的m6A修饰,此前尚属空白。王泽峰研究员此前已发现在环状RNA上插入IRES(核糖体进入位点)序列可促进环状RNA的翻译,然而在对照序列样品中,竟然也发现有蛋白的翻译。通过对这个看似矛盾的现象进行仔细的分析,研究人员发现所有的对照序列竟然都包含m6A修饰位点,这提示m6A修饰可促进环状RNA的翻译(图1)。

研究人员通过分析MeRIP-seq数据,证明內源环状RNA确实含有m6A修饰,并利用IP,RIP和CLIP-seq等技术,发现m6A的阅读蛋白YTHDF3可与翻译起始因子eIF4G2高结合,促进翻译(图2)。

以上实验证明在体外构建含m6A修饰的环状RNA,导入细胞后可以翻译,那么内源的含m6A修饰的环状RNA是否可以翻译呢?遗憾的是,研究人员在对蛋白质组的质谱进行分析后,并未找到符合他们预测的环状RNA编码的肽段。

如果说找到内源可翻译的环状RNA是为它摘掉“非编码”帽子的铁证,那么接下来这两篇Molecular Cell的文章可以说大大减少了上篇文章的遗憾。

意大利科学家Irene Bozzoni发表《Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis》的研究,证明在肌肉发育过程中发挥关键作用的环状RNA Circ-ZNF609,可翻译小肽。

研究者首先通过RNA测序技术,在人和老鼠的肌肉发育模型中鉴定到一系列差异表达的环状RNA,通过大规模的功能筛选,最终确定circ-ZNF609在肌肉发育中扮演重要角色。在探究circ-ZNF609促进肌肉发育的分子机制时,研究人员惊喜的发现circ-ZNF609具有开放阅读框,暗示其具有编码蛋白的能力。将体外构建的含FLAG标签的环状RNA载体导入细胞后,通过western blot的检测,可以看到在目的位置有明显的条带,说明人工构建的带FLAG标签的circ-ZNF609是可以翻译的(图3)。

那么,内源的circ-ZNF609同样可以翻译吗?为了解决这个问题,研究者利用CRISPR技术,将FLAG标签敲入circ-ZNF609的编码区域以检测内源蛋白的表达。由于筛选到的单克隆细胞只成功地在一个circ-ZNF609基因座位插入了FLAG标签,而circ-ZNF609的等位基因则仍是野生型,理论上导致能检测到的蛋白量减半,所以并未能通过western blot检测到内源蛋白的表达。研究者将目光转向蛋白质谱的方法,并在质谱的肽段比对中成功得到了circ-ZNF609的肽段(图4)。

综合以上结果,研究者证明了环状RNA circ-ZNF609具有翻译的能力,但是关于circ-ZNF609促进肌肉细胞发育的功能,研究者并没有解释这是环状RNA本身的功能,还是其编码的蛋白的功能。未来还需要更多的研究来探索该类新来源的蛋白的功能及机制。

以色列科学家Sebastian Kadener的文章《Translation of CircRNAs》则是通过生物信息学预测环状RNA的开放阅读框,结合核糖体展示技术的数据,分析可与核糖体结合的环状RNA,从而系统地分析了果蝇中具有编码潜能的环状RNA,表明环状RNA的翻译能力在进化上可能是保守的,并发现果蝇中大部分可翻译的环状RNA与其线性的mRNA共享翻译起始序列,暗示环状RNA翻译的产物与线性mRNA的产物具有类似的5’端结构(图5)。

以上三篇文章,在人,小鼠和果蝇中鉴定了一批具有翻译潜能的环状RNA,那么同样是非编码RNA的长非编码RNA可以翻译出蛋白吗?其实早在2011年,美国科学家Jonathan S. Weissman就通过核糖体展示技术发现有大量的lincRNA结合在核糖体上,表明它们有可能被翻译(图6)。黑点表示lincRNA,蓝点表示蛋白编码基因的编码区(protein-coding),可以看出有很多lincRNA与protein coding有相同的翻译效率(translational efficiency)。

2016年,Nature上发表John G. Clohessy和 Pier Paolo Pandolfi的研究成果《mTORC1 and muscle regeneration are regulated by the LINC00961-encoded SPAR polypeptide》,发现之前被鉴定为长非编码RNA的LINC00961有编码的能力,其编码的小肽SPAR可抑制mTORC1的活性。值得注意的是,研究人员制备了SPAR的内源抗体,证明该非编码RNA编码的小肽确实在体内存在。进一步的实验证明,如果突变小肽的起始密码子ATG,可以在不影响LINC00961表达的情况下,使小肽不表达,而这样的变体是不具备抑制mTORC1活性的功能的。该实验说明LINC00961以其编码的小肽发挥功能,而不是RNA本身(图7)。

看到这,大家是不是已经跃跃欲试了呢?小编要啰嗦几句,关于非编码RNA可编码的研究,还需大胆假设,小心求证。

2012年,nature chemical biology发表John L rinn和alan saghatelian的论文《peptidomic discovery of short open reading frame–encoded peptides in human cells》。该研究通过对蛋白质谱的分析,鉴定了新的小肽,并利用肽段序列比对回基因组来确定产生的新的小肽的基因。他们发现只有极少数的小肽来源于ncRNA,说明大部分ncRNA是不翻译的(图8)。

而2013年Cell上的文章,则更加直白,Eric S. Lander发表题为《Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins》,该研究认为,现在大部分关于非编码RNA可编码的研究都基于对核糖体展示技术的数据分析,不可否认,确实有很多非编码RNA结合在核糖体上,但这并不意味着它们被翻译了。得出这样惊人的结论,主要是基于核糖体在mRNA的结合是一个动态过程(图9.1)。40S的核糖体小亚基首先结合在5’UTR区,识别到起始密码子的时候,60S的核糖体大亚基才会与小亚基结合,形成80S的复合体。这样的翻译复合体在遇到终止密码时会分离开,所以理论上3’UTR是不应该存在核糖体结合的。传统的RNA翻译效率的计算,只考虑了RNA在核糖体上结合的数量,而没有考虑核糖体在RNA的非翻译区的释放过程,所以研究者重新定义了翻译效率的计算公式(图9.2),只有当核糖体在同一条RNA的翻译区(ORF)结合量明显高于非翻译区的结合量,才认为该RNA是被翻译的。经过这样的计算,大部分的lincRNA与mRNA的翻译区都区别开了(图9.3)

通过以上9幅图的梳理,我们可以看出,有关非编码RNA可编码的研究,一直非编码RNA领域的热点和难点,虽然个别环状RNA和长非编码RNA产生的小肽被证明有功能,但是大部分的研究多还集中在鉴定和预测上。如果想要在该领域取得突破的成绩,并不轻松,难点在与如何证明非编码RNA产生的小肽是内源的以及他们的功能机制又是什么。未来期待有更多的研究和方法,打开非编码RNA的编码大门!

来源:生物谷

本周科研进展

  1. 中日前,由范德堡大学医学中心和亚利桑那大学药学院领导的研究小组创建了第一个与人类白细胞抗原基因变异相关疾病的综合索引。该索引可以帮助研究人员确定那些存在某些自身免疫性疾病风险,或者可能产生针对感染而攻击其自身组织的抗体的个体。相关文章于5月10日发表在Science Translational Medicine杂志上。
  2. 5月8日,Nature Medicine杂志在线发表最新研究,科学家们采用综合法——MSK-IMPACT开展了一个大规模的、前瞻性的临床测序项目,收集了10000多名晚期癌症患者的肿瘤及正常组织DNA序列、病理以及临床注释等各方面的数据。使用这些数据,他们确定了临床相关的体细胞突变、新的非编码区突变以及常见肿瘤与罕见肿瘤共享的突变标签。研究人员将所生成的数据集对外共享,使人们能够发现新的生物标志物以及针对罕见突变开展更深入的研究。
  3. 近日,中国科学技术大学生命科学学院高平课题组和张华凤课题组在肿瘤代谢基因调控研究领域取得新进展,相关研究成果在线发表于《自然 - 通讯》杂志。研究发现组蛋白甲基化转移酶复合物中的一个共调控因子 Menin 在 c -Myc 介导的基因调控、肿瘤代谢和肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。在机制上,他们发现 Menin 能够通过增强 c -Myc 的转录活性进而影响体内外肿瘤细胞的代谢及增殖。
  4. 近日,一项刊登在国际杂志The Journal of Experimental Medicine上的研究报告中,来自国外的研究人员通过研究发现,特定白细胞产生的microRNA分子能够抑制肠道组织的过度炎症表现,研究者指出,合成形式的microRNA分子能够降低小鼠机体肠道的炎症,本文研究或许就为后期研究人员开发治疗克罗恩病或溃疡性结肠炎的新型疗法提供了新的思路和希望。
  5. 在一项发表在国际学术期刊Nature Genetics上的研究中,来自冷泉港实验室的一支研究团队对癌细胞中除外显子之外其余98%的DNA进行了研究。他们收集了308名胰腺癌病人样本,并且胰腺癌细胞的整个基因组都得到了测序。研究人员将他们的研究重点缩小到基因的启动子,由于启动子位于它们调控的基因附近,并不在基因内部,因此在进行外显子测序时,启动子是不可见的。
  6. 日前,在一组人类结肠癌细胞及小鼠实验中,约翰霍普金斯大学Kimmel癌症中心的科学家表示,他们有证据表明,当用来修复DNA的一部分细胞机制遭到损坏,无法完成它们的正常工作时,癌症就发生了。研究人员表示,如果进一步的研究证实了这些发现,可能会引导科学家研发全新的靶向分子抗癌药物或新型癌症复发的检测。
  7. 5月2日,《细胞生物学杂志》在线发表了中国科学院上海生命科学研究院何杰的最新研究。研究采用基于彩虹鱼克隆分析,在单细胞水平上揭示了视网膜干细胞在视网膜睫状边缘区的准确定位;同时在边缘区中发现一类目前尚未报道的静息态细胞。此项工作发现了视网膜干细胞发育的细胞谱系基础,为进一步揭示视网膜干细胞发育的分子机制,最终实现视网膜干细胞微环境的体外重建提供重要的实验依据。
  8. 日前,一项刊登在国际杂志the American Journal of Human Genetics上的研究报告中,来自伦敦大学学院和帝国理工学院的研究人员通过研究在人类基因组中鉴别出了111个新型的能够指示个体对糖尿病易感的染色体位点,从而就为研究人员理解2型糖尿病发生的原因提供了新的思路和希望。

    【新技术】

    1. Picopore: A tool for reducing the storage size of Oxford Nanopore Technologies datasets without loss of functionality.Gigante S.F1000Res. 2017 Mar 7

    【植物】

    1. Target enrichment sequencing in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.) using probes designed from transcript sequences.Peng Z et al.Mol Genet Genomics. 2017 May 10.

    2. De novo Sequencing and Transcriptome Analysis Reveal Key Genes Regulating Steroid Metabolism in Leaves, Roots, Adventitious Roots and Calli of Periploca sepium Bunge.Zhang J et al.Front Plant Sci. 2017 Apr 21

    3. Genome sequencing and population genomic analyses provide insights into the adaptive landscape of silver birch.Salojärvi J et al.Nat Genet. 2017 May 8.

    【微生物】

    1. Bifidobacterium bacteremia - clinical characteristics and a genomic approach to assess pathogenicity.Esaiassen E et al.J Clin Microbiol. 2017 May 10.

    2. EthA/R-Independent Killing of Mycobacterium tuberculosis by Ethionamide.Ang MLT et al.Front Microbiol. 2017 Apr 25

    3. Functional mapping of yeast genomes by saturated transposition.Michel AH et al.Elife. 2017 May 8

    4. Complete genome sequencing and clinical analysis of intrahepatic hepatitis B virus cccDNA from HCC.Jiao F et al.Microb Pathog. 2017 May 3.

    【肿瘤】

    1. Current status of research and treatment for non-small cell lung cancer in never-smoking females.Saito S et al. Cancer Biol Ther. 2017 May 11

    2. Transcriptome-wide analysis of alternative RNA splicing events in Epstein-Barr virus-associated gastric carcinomas.Armero VES et al.PLoS One. 2017 May 11

    3. Novel translational therapeutic strategy by sequencing primary liver cancer genomes.Glantzounis GK et al.Future Oncol. 2017 May 11.

    4. Pancreatic cancer ascites xenograft-an expeditious model mirroring advanced therapeutic resistant disease.Golan T et al.Oncotarget. 2017 Apr 19.

    5. Transcriptome profiling identify a recurrent CRYL1-IFT88 chimeric transcript in hepatocellular carcinoma.Huang Y et al.Oncotarget. 2017 Apr 19.

    6. Sequencing of cancer cell subpopulations identifies micrometastases in a bladder cancer patient.Prado K et al.Oncotarget. 2017 Apr 21.

    7. Major Tumor Suppressor and Oncogenic Non-Coding RNAs: Clinical Relevance in Lung Cancer.Inamura K.Cells. 2017 May 9

    8. Identification of aberrantly expressed long non-coding RNAs in stomach adenocarcinoma.Gu J et al.Oncotarget. 2017 Apr 21.

    【其他】

    1. A report of whole-genome sequencing in neurologic Wilson's disease.Anwarullah A ert al.Neurol India. 2017 May-Jun

    2. Whole-genome sequencing identifies homozygous BRCA2 deletion guiding treatment in dedifferentiated prostate cancer.Purshouse K et al.Cold Spring Harb Mol Case Stud. 2017 May

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本文由 测序中国 作者:戴胜 发表,转载请注明来源!

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