随着基因检测技术的不断发展，肿瘤早诊早治和精准治疗从以往遥不可及的梦想慢慢照进现实。与此同时，临床的真实需求呼唤着检测手段向着更精准、更灵敏、周期更短、成本更低的目标不断迭代和更新。

作为一家专注于肿瘤全病程管理的基因检测企业，和瑞基因自2017年成立以来便以“临床有效，患者获益”为中心开展了卓有成效的技术创新和临床推广，并在不到三年的时间里以惊人的速度成为了行业的代表者。而这一切的基础与核心是其具有完全自主知识产权、全球创新性和专利保护的基因突变检测技术——cSMART（Circulating Single-Molecule Amplification and Resequencing Technology，即环化单分子扩增和重测序技术）。今天，就让我们通过真实的数据与最新的临床研究揭开它神秘的面纱，了解cSMART技术在肿瘤精准诊疗中的应用前景，感受中国肿瘤基因检测先行者精益求精、坚持自主创新的可贵品质。

一、准确定量低频突变有一套，cSMART助力基因编辑脱靶位点检测

近年来，基因编辑技术快速发展，它在肿瘤精准治疗领域的应用前景也备受关注。四川大学华西医院胸部肿瘤科卢铀教授团队联合和瑞基因等开展的一项研究近日发表于Nature Medicine杂志（IF=30.6）。

该项I期临床试验入组12名多线治疗失败的非小细胞肺癌患者，利用CRISPR-Cas9敲除了T细胞的PD-1基因，然后体外扩增后回输患者体内，并评估了CRISPR-Cas9编辑T细胞的安全性和可行性。毋庸置疑，该研究是基因编辑应用于肿瘤精准诊疗的发展历程中一个里程碑式的成果，而基于cSMART技术的高深度靶向测序和全基因组测序在脱靶位点的精准检测中发挥了关键性的作用。

CRISPR-Cas9系统能帮助研究人员快速有效地对基因组进行有针对性的切割，然而，脱靶效应的存在一直是将该技术应用于临床的阻碍。如果在具有相似序列的非预期位置上发生切割，就有可能产生损害细胞功能或直接杀死细胞的有害突变，极大影响临床安全性。因此，使用能准确寻找脱靶位点的方法有重要意义。和瑞基因医学总监高芸博士向测序中国详细介绍了该研究的实验设计：首先基于gRNA序列，利用sgRNAcas9预测出了18个可能的脱靶位点（off-target）。针对这18个off-target区，和瑞基因设计了36对背靠背式的引物，使用专利的cSMART对这12个患者的血液样本进行了高深度靶向测序（20,000 x），结果显示off-target位点的突变频率较低（中位突变频率为0.05%[0-0.25%]）。且绝大部分脱靶突变位于基因间区（48.1%）和内含子区（35.1%），这些区域对编码基因不会造成显著影响。研究人员又利用Cas-OFFinder软件在全基因组范围内预测出了2086个off-target位点，并进行全基因组测序（WGS），在这2086个位点上下游15bp未发现有脱靶现象。

作为在中国、美国、欧洲均获得专利认证的先进技术，cSMART技术的一些重要特征在这项研究中体现得淋漓尽致。在血液样本中检测低频突变对于技术灵敏性的要求极高，常规的突变检测技术难以达到。高芸博士介绍说，cSMART采用创新性的单分子条码组（UMG）设计，为血浆中含量极低的ctDNA分子添加独立标签，一方面使得绝对定量成为可能，另一方面可以将样本串扰的概率降到最低。标签连接后对ctDNA进行环化，并设计“背靠背”引物进行PCR扩增，这样一来，对于传统方法无法检出的接近核酸分子两端的突变位点，也可以做到精准检出，不放过肿瘤的任何蛛丝马迹。值得期待的是，随着基因编辑技术被越来越多地应用于临床研究和肿瘤精准诊疗，cSMART技术也将作为检测评估脱靶效应的有效手段得到更广泛的应用。

图1：A，利用cSMART技术检测18个脱靶位点的突变情况；B，利用WGS检测2086个脱靶位点的突变情况

二、新生抗原无处逃，cSMART实现免疫治疗中的动态监测

肿瘤新生抗原（Tumour-associated neoantigen）是一种由肿瘤特异性突变所产生的个体化肿瘤抗原，在肿瘤免疫治疗过程中起着关键作用。通过检测外周血循环肿瘤DNA（Circulating tumour DNA ，ctDNA）中编码肿瘤新生抗原的相应核酸片段可以对肿瘤新生抗原进行动态监测。高芸博士指出，由于个体间的HLA多样性和肿瘤基因组的高度异质性，对所有肿瘤患者使用以一概全的商业基因探针Panel难以实现对新抗原的动态追踪，相比之下，借助高灵敏度的定制探针Panel（Individually Customized Panel，ICP）个性化地覆盖特定患者的新生抗原编码基因片段是临床上的更优选择。那么，ICP在实际应用中的表现究竟如何呢？

近日，陆军军医大学第二附属医院肿瘤科朱波教授团队与和瑞基因合作，基于cSMART技术，利用个体化探针Panel实现了免疫检查点抑制剂治疗过程中肿瘤新生抗原的动态追踪，相关研究结果以封面文章发表在Advanced Science杂志（IF=15.804）。

该研究纳入了进行免疫治疗且缺乏EGFR突变和ALK-EML4融合的IIIB/IV期非小细胞肺癌患者。取治疗前的肿瘤组织和配对的外周血样本进行了全外显子测序（WES），又对治疗过程中的血液样本进行ctDNA检测。基于WES数据对新抗原进行预测，在每位患者中鉴定并筛选出亲和力得分较高的新抗原编码基因片段纳入到ICP中。进一步的研究显示，以cSMART为基础的高灵敏度的定制探针Panel带来了远超传统方法的惊艳表现。在基线采样点样本中，ICP中的基因突变中位检出率为80%（35%~95%），而在整个治疗期间， 90%的ICP中基因突变（80%~100%）被检测到至少一次（图2A）。高芸博士告诉测序中国，研究团队将Panel覆盖的基因与入组患者的新抗原，以及TCGA中非小细胞肺癌病例基因组图谱数据分别进行了比较。两种比较的结果均显示出，ICP Panel的检出基因数明显高于另外5个商用Panel（图2B）。以上结果有力地证明了ICP检测的可靠性和有效性。

图2：A，患者个性化Panel（ICP）的ctDNA测序结果；B，WES突变谱与ICP (红)、其他商用Panel（蓝）重叠的基因数

更准确和有针对性的检测，为我们打开了肿瘤动态监测和个性化管理的大门。研究数据显示，在ICB治疗期间ctDNA水平下降较大的患者中，具有临床获益的患者明显增多，而在ctDNA变化相对较小的患者中临床获益的患者则较少（图3A）。此外，评估肿瘤负荷下降50%的时间，用ICP测定的ctDNA水平来衡量平均是32.4天，而用影像学评估则是78.4天（图3B）。这些结果表明，基于ICP的ctDNA测序作为一个比影像学更敏感的监测手段，可以用于鉴别ICB治疗的临床反应和生存获益情况。

图3：A，ICB治疗后新抗原ctDNA下降与临床结局的相关性；B，患者SPD与ctDNA丰度下降50％的不同时间

基于cSMART技术的ICP为什么能够在血液里含量极低的ctDNA中测到更多的新生抗原编码基因？高芸博士做出了详细的阐释： 升级后的cSMART经过特殊优化的捕获流程有着极高的原始分子捕获率和高目标区中靶率，从源头上保证最大化地提取基因组信息；独特的短接头设计有效降低极低接头污染率，提高接头连接效率，提升建库稳定性。层层加持下，cSMART得以捕捉到低起始量样本中超低频率的突变，作为兼具灵敏度和特异性的检测手段，从各种技术路线中脱颖而出，用于免疫治疗后患者ctDNA中新生抗原的动态监测。升级后的cSMART可以覆盖六百多个基因的全部外显子区域，而不仅仅是热点突变区，这种覆盖广度上的优势为SNV、InDel的检出和肿瘤突变负荷（TMB）的准确评估提供了很大帮助。

不仅仅是新生抗原追踪，cSMART高灵敏度、高检出率的优势在肿瘤早筛、复发监测等领域将有极大的用武之地。高芸博士为我们带来了更多临床研究的实例：在其中一项研究中，和瑞基因与王红阳院士及侯金林教授团队合作，开展全国多中心、前瞻性肝癌极早期预警筛查标志物项目（PreCar），该项目通过对肝癌病人、肝硬化病人及健康人外周血cfDNA 进行低深度全基因组、高深度靶向测序及羟甲基化检测，整合多种组学、多维度指标构建分类器。研究结果表明分类器性能优良，区分肝癌和肝硬化病人得回归分析验证性能达到AUC=0.992，灵敏度和特异性分别达到93.10%和96.04%，相比传统血清标志物和单组学指标优势明显。另一项和瑞基因与北京大学人民医院王俊院士团队合作的肺癌患者围手术期ctDNA动态变化研究发现，ctDNA较影像学可以提前165天发现肿瘤复发，且在术后辅助治疗的患者中ctDNA的检出与治疗疗效相关。作为亚洲第一项应用ctDNA监测肺癌术后微小病灶残余的研究，为非小细胞肺癌的临床决策及患者的精准治疗提供了宝贵的参考依据。

三、结语

没有精准的诊断，就没有精准的治疗；要实现精准的诊断，离不开先进实验技术的支撑。多重目标考验着研发团队的技术水准：更低的起始量，更高效、均一的捕获，更灵敏、更特异的检测，更大的覆盖区域，更多的检测类型（融合基因、甲基化等），以及简便的操作和患者可负担的成本。在无数临床医生、科研工作者和基因检测行业从业者的不懈努力下，新的技术不断推出，新的成果不断涌现，而cSMART技术绝对是其中不容忽视的一个，凭借其高效、灵敏、可绝对定量的突出优势，在肿瘤的科研探索和临床诊疗中发挥着日益重要的作用，为患者带来切实的治疗帮助。

疫情给我们的生活按下了暂停键，但是创新的脚步却未曾停止。和瑞基因的专利技术cSMART在基因编辑脱靶效应检测、肿瘤新生抗原监测、肿瘤早筛、围手术期肿瘤动态监测等方向上的成功应用，使得我们有理由相信，肿瘤精准诊疗的前沿领域将会出现更多的中国声音，推动我国肿瘤防治水平进一步提升，科研成果转化进一步加速，为人民健康做出更大的贡献。