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纳米孔蛋白质测序新突破!可识别15种氨基酸,蛋白组学测序未来可期 | Nat Biotech

蛋白质是执行生物功能的主要分子,许多无法从基因层面解释的疾病,蛋白层面可以给出我们想要的答案。为此,蛋白质组学应运而生。科学家们预测,随着人类基因组测序工作的完成,21世纪生命科学的研究重心或将从基因组学转移到蛋白质组学。蛋白质组学是后基因组时代生命科学研究的核心内容,想要深入了解蛋白质,进一步认识生命活动和疾病发生的分子机制,首先要有合适的蛋白质测序技术做支撑。为完善蛋白质测序技术科学家做出了许多尝试。然而已有的测序方法都存在各种技术不足与应用局限性,不利于蛋白质组学在整个生命科学和生物医学研究中的应用推广。

日前,来自法国塞吉-蓬图瓦兹大学、美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校及法国初创公司DreamPore的研究人员成功开发了一种基于纳米孔技术的蛋白质组学测序系统该系统借助于短聚阳离子载体,能够对气溶素纳米孔中所有20种天然蛋白质氨基酸中的15种进行识别。这一成果对纳米孔蛋白质测序可行性进行了论证,并为开发相关临床应用奠定了基础。相关研究成果于12月16日在线发表于学术期刊《自然—生物技术》(Nature Biotechnology)。

当前,以英国Oxford Nanopore为代表的企业已成功将纳米孔技术应用于核酸测序。包括Oxford Nanopore公司在内的研究人员也在探索如何利用纳米孔技术进行蛋白质分析,当前的主要探索方向是通过寡核苷酸适配子或抗体等亲和分子对纳米孔进行功能化,蛋白质或肽分子通过纳米孔时读取氨基酸序列。由于不同分子在纳米孔附近的结合或通过会引起不同幅度的电流变化,因此基于这些变化就可以检测和表征分子,从而得到所测蛋白质的序列信息。

图:利用气溶素纳米孔对20种蛋白质氨基酸进行电识别,来源:Nature Biotechnology

在本篇Nature Biotechnology文章中,研究人员使用了一种气溶素纳米孔来检测单个氨基酸并将氨基酸附着在聚阳离子载体分子上,以确保它们能在纳米孔内停留足够长的时间,以便收集有关电流变化的足够信息。分子动力学模拟的应用表明,气溶素纳米孔具有内置的单分子阱,其将聚阳离子载体结合的氨基酸完全限制在气溶素的感应区内。这种结构特征意味着每种氨基酸在孔中花费足够的时间来敏感地测量氨基酸的排除体积。利用一个野生型气溶素纳米孔,研究人员发现不同的电流屏障可用于识别20种天然氨基酸中的13种通过对氨基酸进行化学修饰,研究人员将这一数字提高到15种。虽然研究人员可以检测并记录纳米孔中的其余5种电流变化,但这些变化太过相似,还无法清楚地加以区分。但研究也表明,化学修饰、仪器的进步和纳米孔工程技术为鉴定剩余几种氨基酸提供了一条途径

论文共同通讯作者、伊利诺伊大学生物物理学教授Aleksei Aksimentiev表示,研究人员探索了多种方法来改善这些初步结果,包括改进纳米孔以延长氨基酸的停留时间或对目标氨基酸进行不同的化学修饰。

论文共同通讯作者、塞吉-蓬图瓦兹大学研究员Abdelghani Oukhaled也指出,降低当前检测电流变化的背景噪声也可能有助于提供足够的分辨率,以区分完整的20种氨基酸。他还表示,虽然文章中研究人员未能完全区分所有的20种氨基酸,但研究结果也表明这种方法是可能实现的。“这给了我们信心。我认为纳米孔蛋白质测序是可行的。”

据悉,除了优化系统以识别所有20种氨基酸,研究团队下一步还将开发一种方法以驱动单个氨基酸进入纳米孔并使其有足够的停留时间,而无需本项研究所使用的聚阳离子载体为此,研究人员正在探索一种利用水流的方法来达到这一目的。“我们的想法是利用一种酶把肽分解成单个氨基酸,迫使氨基酸进入传感器。我们需要一种驱动力,而我们的想法就是利用水流。”DreamPore公司的联合创始人Juan Pelta介绍,“气溶素纳米孔有很多优点,包括它的高稳定性等其他能力,因为它是一种蛋白质,所以我们可以通过基因改变它的特性。改变孔径和通道电荷意味着可以调整肽和通道之间的相互作用。”

除了以上优化之外,研究人员还利用这一系统对修饰过的肽进行了检测。Juan Pelta指出,仅仅能读懂氨基酸是不足以获得蛋白质序列的,检测翻译后修饰也很重要。他介绍,其团队目前已经能够检测到包括蛋白质磷酸化在内的各种纳米孔信号变化

在这篇论文中,研究团队还提出了将该技术应用于蛋白质组学测序的设想:使用化学或酶学方法从目标蛋白的一个拷贝中按顺序切割末端氨基酸,然后将其导入纳米孔。他们指出,这个过程可以在大量的“电隔离体”(electrically isolated volumes)上并行完成。

从长远来看,DreamPore公司希望开发能够大规模测序蛋白质及多肽的技术平台。短期内,该公司将与医院合作,致力于开发针对脑癌复发生物标志物的靶向检测平台。未来,该公司表示将不仅仅停留在纯科研领域,而是进一步进入医疗行业,利用纳米孔技术帮助解决临床需求。该公司预计在未来几年内,在证明该平台的技术有效性并开展脑癌标志物相关临床应用后,其团队将进一步开发相关的IVD检测产品。

参考资料:

1. Ouldali, H., Sarthak, K., Ensslen, T. et al. Electrical recognition of the twenty proteinogenic amino acids using an aerolysin nanopore. Nat Biotechnol (2019) doi:10.1038/s41587-019-0345-2

2. Nanopore Protein Sequencing Feasibility Demonstrated by French Startup, Collaborators

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本文由 测序中国 作者:陈初夏 发表,转载请注明来源!

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